Protein-Ligand Interaction
Responsible
People involved
From BIFI:
Olga Abián
Ernesto Freire
Carlos Gómez-Moreno
Beatriz Ibarra
Marta Martínez-Júlvez
Milagros Medina
José Luis Neira
Antonio Parody-Morreale
José Manuel Sánchez-Ruiz
Javier Sancho
Xabier Arias
Sara Ayuso
Marta Bueno
Luis A. Campos
Nunilo Cremades
Jorge Estrada
Susana Frago
Guillermina Goñi
José Ramón Peregrina
Ana Serrano
Grupo de Interacción Proteína-Ligando
I. Introducción
Las proteínas son macromoléculas biológicas formadas por unidades denominadas aminoácidos y juegan un papel muy importante en el funcionamiento de cualquier organismo. El DNA contiene la información codificada para su fabricación y son sintetizadas en los ribosomas.
Las proteínas hacen posible todas las funciones de un ser vivo. Adoptan una estructura espacial tridimensional organizada y ordenada, estrechamente relacionada con su función específica. La función desempeñada por cada proteína puede estar regulada mediante la interacción con otras proteínas y diferentes tipos de moléculas de bajo peso molecular (moléculas orgánicas pequeñas o metales) denominadas ligandos, cuya función puede ser de regulación (actuando como activadores e inhibidores) o constitutiva (cofactores), de modo que dicha interacción permite o imposibilita la función de la proteína. Normalmente la interacción con otras moléculas provoca un cambio en la conformación tridimensional de una proteína y, por tanto, modula su función.
El mal funcionamiento de una o varias proteínas es la causa de numerosas enfermedades genéticas. Mutaciones (cambios en la secuencia primaria de aminoácidos) pueden provocar un plegamiento erróneo de la molécula o una alteración estructural que afecta a la función, desencadenando un proceso patológico. Existen diversas estrategias para combatir la enfermedad: 1) introducción en el organismo de una versión correcta de la proteína (terapia génica); 2) inactivación de la proteína que presenta una función alterada o no regulada mediante fármacos (bloqueo o inhibición); 3) rescate de la conformación estructural y la función correcta mediante fármacos. Otras enfermedades están causadas por agentes infecciosos (ej. virus, bacterias, protozoos, etc.). Un modo de combatir la enfermedad consiste en bloquear una etapa o una función vital clave en el ciclo de vida del micro-organismo infeccioso (bloqueo o inhibición). Por tanto, entender el comportamiento de las proteínas y sus interacciones abre una puerta hacia el desarrollo racional de fármacos.
En general, todos los organismos poseen funciones comunes. Por ello, aunque existen genes específicos de cada especie, muchos genes y proteínas son similares entre diferentes especies. Ello hace especialmente importante la secuenciación y decodificación del genoma de diferentes especies. Mediante el estudio comparado de genomas es posible: 1) determinar genes y sus funciones; 2) realizar estudios con especies modelo para estudiar la función de ciertos genes y las proteínas que codifican; 3) estudiar el funcionamiento anómalo de ciertos genes y proteínas; 4) identificar y evaluar dianas terapéuticas para el desarrollo de fármacos contra agentes infecciosos; 5) evaluación de fármacos potenciales.
II. Investigación
En el grupo de Interacción Proteína-Ligando estudiamos la interacción entre proteínas y otras moléculas. En general, interacciones intermoleculares de diferentes tipos:
- proteína-ligando
- proteína-proteína
- proteína-ácido nucleico
desde un punto de vista experimental y computacional.
La caracterización de una interacción intermolecular consiste en dar respuesta a ciertas preguntas acerca de la interacción entre dos o más moléculas:
- ¿Es específica o inespecífica?
- ¿Cuál es la fortaleza de la interacción?
- ¿Cómo influyen las variables experimentales (temperatura, pH, etc.)?
- ¿Qué ocurre si se modifican las moléculas interaccionantes?
- ¿Cuáles son las interacciones atómicas determinantes?
Se pueden destacar diferentes líneas generales de investigación básica e investigación aplicada:
Investigación básica
- Estudio experimental de interacciones moleculares
- Estudio computacional de interacciones moleculares
- Cribado (virtual y experimental) de quimiotecas
- Optimización de ligandos e interacciones moleculares
Investigación aplicada
- Optimización de ligandos e interacciones intermoleculares
- Desarrollo de fármacos
- Rediseño de la función proteica
III. Area de Investigación
En el Instituto BIFI existen instalaciones y laboratorios con instrumentación de vanguardia en biología molecular, bioquímica y biofísica para la caracterización experimental de proteínas y otras moléculas de interés biomédico y sus interacciones. Además, se dispone de un laboratorio de biocomputación para el estudio teórico de interacciones intermoleculares y la caracterización y análisis de la energética de unión.
Biología Molecular y Bioquímica
Este laboratorio está especializado en la producción (clonación, expresión y purificación) de proteínas recombinantes de interés biotecnológico o biomédico, para ser posteriormente caracterizadas y utilizadas como dianas terapéuticas.
Biofísica Experimental y Biología Estructural
Las interacciones intermoleculares se pueden describir a un nivel de resolución atómica o globalmente, y pueden estudiarse cinética (velocidad de reacción) o termodinámicamente (equilibrio químico).
Técnicas tales como cristalografía de rayos X o NMR, en que se pueden medir parámetros atómicos individuales, permiten una caracterización detallada al nivel de resolución atómica. Aunque proporcionan alguna información sobre la energética de unión, normalmente ofrecen una descripción estructural de la interacción.
Por otra parte, técnicas espectroscópicas y calorimétricas, que proporcionan información global sobre el proceso de unión, se emplean para llevar a cabo una caracterización termodinámica global. Una caracterización global de una reacción intermolecular implica la determinación de la estequiometría y el cambio de los potenciales termodinámicos entre el estado inicial y final: afinidad, energía de Gibbs, entalpía y entropía de unión. Los parámetros del equilibrio de unión se obtienen fenomenológicamente mediante regresión no-lineal de la señal medida experimentalmente (calor, absorbancia, fluorescencia, etc.) proporcional al avance de la reacción. Estas técnicas proporcionan, por tanto, una descripción energética de la interacción. Adicionalmente, cambiando las variables experimentales (temperatura, pH, etc.) y modificando las moléculas interaccionantes, es posible obtener información sobre las interacciones atómicas determinantes en el proceso de unión (enlaces de hidrógeno, van der Waals, electrostáticas, etc.).
Se dispone de técnicas analíticas estándar y avanzadas para la caracterización de procesos de unión y reacciones enzimáticas:
- calorimetría isotérmica de valoración (ITC)
- calorimetría diferencial de barrido (DSC)
- espectrofotometría
- espectrofluorometría
- dicroísmo circular
Las técnicas calorimétricas son especialmente apropiadas para la caracterización energética, debido a que el observable directo es el calor de reacción. ITC permite la determinación directa de la entalpía de unión sin necesidad de modelos o hipótesis adicionales. Proporciona una de caracterización energética completa en un único experimento. Además, presenta otras ventajas frente a las técnicas espectroscópicas: no requiere la utilización de cromóforos o fluoróforos y el intervalo de determinación de afinidad se extiende desde 102 M-1 (10 mM) hasta 1012 M-1 (1 pM). En el laboratorio de calorimetría del BIFI se ha desarrollado software para el análisis de diferentes reacciones de unión: macromolécula con varios sitios de unión, macromolécula "lattice-like" con sitios de unión superpuestos, unión acoplada a asociación/disociación, disociación de oligómeros, etc.
Aunque DSC es una técnica más apropiada para la caracterización de la estabilidad conformacional de proteínas mediante desnaturalización térmica, es posible obtener información energética sobre la unión de un ligando a partir su efecto estabilizador.
Las técnicas espectroscópicas permiten determinar la afinidad de unión. Sin embargo, la determinación de los demás parámetros termodinámicos es problemática.
Además, es posible estudiar reacciones de unión cinéticamente. Para ello se dispone de un espectrómetro con detectores integrados para la medida simultánea de absorbancia, fluorescencia y dicroísmo circular un una unidad de "stopped-flow".
Biofísica y Biología Estructural Computacional
En este laboratorio se emplean algoritmos computacionales, basados en parametrizaciones de la energética y diferentes campos de fuerza, para predecir y describir la energética de unión. De esta forma es posible validar diferentes modelos teóricos y campos de fuerzas utilizando los datos obtenidos la caracterización experimental. Como extensión de este objetivo, es posible utilizar y desarrollar aplicaciones de optimización de acoplamiento de ligandos para tareas de diseño racional y cribado de quimiotecas virtual de alto rendimiento. Para realizar simulaciones de dinámica molecular y Monte Carlo se dispone del cluster del laboratorio de Computación del Instituto BIFI.
Optimización de Ligandos
Este laboratorio se centra en la integración de información experimental (energética y estructural) y computacional para la optimización de interacciones intermoleculares. Reuniendo información termodinámica, estructural y genética es posible diseñar y desarrollar fármacos dirigidos a moléculas diana implicadas en enfermedades y procesos infecciosos. Comenzando con la caracterización experimental de la molécula diana (enzima, receptor, etc.) y la identificación (experimental o computacional) de compuestos líder, es posible, a través de un proceso iterativo (experimental y computacional) de estudio cuantitativo de la relación actividad-estructura-energética, optimizar ligandos de acuerdo con diferentes criterios: afinidad de unión, selectividad y/o susceptibilidad a mutaciones de la molécula diana.
Desarrollo de Fármacos Adaptables
La afinidad de unión has sido tradicionalmente el criterio para la optimización de ligandos. Sin embargo, el ligando más potente no es siempre el mejor fármaco, ya que otros factores son importantes: propiedades físico-químicas determinantes de la farmacocinética y biodisponibilidad, susceptibilidad para ser metabolizado, interacciones potenciales con otras moléculas, y susceptibilidad a mutaciones en la molécula diana.
Se ha establecido que ligandos entálpicos y entrópicos poseen un potencial diferente en cuanto a la optimización de la afinidad de unión. En primer lugar, la contribución entálpica refleja fundamentalmente interacciones específicas (van der Waals, electrostática y enlaces de hidrógeno), mientras que la contribución entrópica refleja básicamente interacciones no específicas (entropía de solvatación y conformacional); por tanto, un ligando entálpico asegura un mayor grado de especificidad y selectividad. En segundo lugar, es más fácil incluir modificaciones para aumentar la contribución entrópica de la afinidad y, por consiguiente, iniciar el proceso con un ligando entálpico proporciona una ventaja significativa.
El objetivo final es desarrollar ligandos adaptables capaces de acomodarse a cambios en la molécula diana. Presentan una ligera pérdida de especificidad y selectividad (dentro de ciertos límites) que hacen posible que el ligando sea capaz de unirse a un conjunto de moléculas diana (ej. una familia de proteínas homólogas con cierto grado redundancia en la función; molécula diana con elevada variabilidad debido a una tasa de mutación alta; molécula diana con elevada variabilidad en una población). De este modo, será posible minimizar el fenómeno de resistencia a fármacos habitual en el tratamiento de organismos infecciosos.
El trabajo experimental y computacional sobre los inhibidores de la proteasa HIV-1 y sistemas similares de elevada variabilidad (Dr. Ernesto Freire Lab, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland, USA) han permitido establecer un nuevo paradigma para el desarrollo de ligandos altamente potentes y adaptables para una molécula diana variable.
III. Proyectos
De entre todos los proyectos que están llevando a cabo investigadores adscritos al BIFI destacamos los siguientes:
Desarrollo de Inhibidores Enzimáticos Adaptables
Se ha iniciado un proyecto para el desarrollo de inhibidores potentes y adaptables de la proteasa NS3 del virus de la Hepatitis C (MEC SAF2004-07722). Actualmente no existe una terapia molecular específica y eficaz para esta enfermedad. Esta enzima ha sido confirmada como una diana terapéutica válida recientemente. Existen actualmente inhibidores experimentales, pero no hay aún inhibidores en fase pruebas clínicas. Se espera que el fenómeno de resistencia a fármacos juegue un papel importante en el tratamiento médico de esta enfermedad debido a la extrema tasa de mutación y variabilidad de este virus. Para desarrollar inhibidores eficaces de la proteasa NS3 se empleará y extenderá la estrategia establecida mediante el estudio de los inhibidores de la proteasa HIV-1, que integra información termodinámica (calorimetría), integración estructural (cristalografía y NMR) e información genética (análisis de bases de secuencias) en el proceso de optimización.
Grupos colaboradores: Adrián Velázquez Campoy (UZ-BIFI), Javier Sancho (UZ-BIFI) y Ernesto Freire (Johns Hopkins-BIFI).
Cribado y Diseño de Ligandos de Proteínas e Inhibidores
La actividad y la estabilidad de las proteínas se puede modular mediante la unión de ligandos. El diseño y la identificación de ligandos de proteínas es una necesidad en Medicina e Industria, pudiendo ser de ayuda para comprender las complejas redes de interacciones moleculares existentes en los seres vivos. Estamos desarrollando una metodología para cribado computacional masivo de quimiotecas de fármacos potenciales y para cribado masivo experimental de quimiotecas reales de compuestos químicos. Un objetivo actual es la identificación de inhibidores de la flavodoxina de Helicobacter pylori, que se ha demostrado es esencial para la supervivencia del patógeno.
Grupos colaboradores: Javier Sancho (UZ-BIFI) y Adrián Velázquez Campoy (UZ-BIFI).
Determinantes Cinéticos y Termodinámicos de la Interacción de Proteína/Cofactor
La afinidad de los complejos proteína/cofactor es un reflejo de las interacciones establecidas entre la proteína, el cofactor y las moléculas de agua, y puede ser estudiada mediante una combinación de medidas termodinámicas e ingeniería de proteínas. Una cuestión adicional es el proceso de reconocimiento mutuo de la proteína y el cofactor para formar el complejo funcional conforme las moléculas se aproximan en disolución. Ambos aspectos se están investigando utilizando la flavodoxina de Anabaena.
Grupos colaboradores: Javier Sancho (UZ-BIFI), Carlos Gómez-Moreno (UZ-BIFI) y M. Medina (UZ-BIFI).
Enfermedades Conformacionales
Se ha establecido recientemente que numerosas enfermedades humanas son provocadas por mutaciones puntuales que dan lugar a proteínas inestables o con tendencia a la agregación y que, o bien son incapaces de realizar su función fisiológica o cuyos agregados son perjudiciales. Estamos investigando una enfermedad conformacional muy usual (hipercolesterolemia humana) que es causada por mutaciones en el receptor de LDL que desestabiliza los módulos responsables de la interacción con las lipoproteínas. Nuestro enfoque incluye la expresión y caracterización de los módulos de unión de LDL portando las mutaciones relacionadas con la enfermedad, simulaciones de dinámica molecular de los módulos mutantes y cribado de ligandos estabilizantes.
Grupos colaboradores: Javier Sancho (UZ-BIFI), Fernando Falo (UZ-BIFI), Miguel Pocoví (UZ) y JC Rodríguez (U. Santander).
Rediseño de la función enzimática
Utilizando técnicas de ingeniería de proteínas y caracterización enzimática nos interesa establecer los determinantes de la especificidad de substrato y coenzima e investigar la posibilidad de modificar dicha especificidad para la utilización de otras moléculas orgánicas:
- Estudio de los determinantes de la especificidad de coenzima en Ferredoxina-NADP+reductasa de Anabaena. Cambio de especificidad de coenzima en Ferredoxina-NADP+reductasa.
- Unión y transferencia de electrones en la transferencia de electrones fotosintética desde Fotosistema I a Ferredoxina-NADP+reductasa.
- Estudio de los mecanismos de acción en flavoproteínas redox. Análisis de la versatilidad, adaptación y rediseño biotecnológico de propiedades de la flavina dentro del entrono proteico.
Grupos colaboradores: Javier Sancho (UZ-BIFI), Carlos Gómez-Moreno (UZ-BIFI) y M. Medina (UZ-BIFI).
IV. Actividades
Organización del I International Congress BIFI 2004 y del II International Congress BIFI 2006.
Organización del II Congreso Nacional BIFI 2005.
Organización de la IV Reunión Aragonesa de Estabilidad y Plegamiento de Proteínas y la V Reunión Aragonesa de Estabilidad y Plegamiento de Proteínas.
Numerosas publicaciones en revistas internacionales y comunicaciones a congresos internacionales.
Es de destacar que en el año 2006 se celebrará el simposio internacional "Applications of Biocalorimetry 2006" en Zaragoza. El Instituto BIFI participa en la organización del evento, junto con la empresa patrocinadora MicroCal LLC (Northampton, MA, USA). Se espera que participen unos 100-150 investigadores interesados en los últimos avances y desarrollos en el área de la calorimetría de biomoléculas.
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