Biofísica.

Interacciones Biomoleculares

Responsable de la Línea de Investigación:

Adrian Velazquez-Campoy

Investigadores:

José Luis Neira (Universidad Miguel Hernández, Elche)
David Ortega Alarcón (doctorando FPI)
Ana Jiménez Alesanco (investigadora contratada)

RESUMEN

Todos los procesos biológicos se pueden describir como una secuencia de procesos de interacción entre biomoléculas y cambios conformacionales acoplados a dichas interacciones. Nosotros trabajamos en tres cuestiones fundamentales, desde una perspectiva tanto básica como aplicada, relacionadas con moléculas biológicas:

–Caracterización biofísica de proteínas de relevancia biotecnológica y/o biomédica: paisaje conformacional, interacciones con otras biomoléculas, cambios conformacionales, diagramas de fase, fenómenos cooperativos…

–Desarrollo de metodologías experimentales para el estudio de interacciones biomoleculares, fenómenos cooperativos y regulación funcional en sistemas biológicos.

–Desarrollo e implementación de procedimientos de cribado de alto rendimiento para la identificación de compuestos bioactivos capaces de modular la función de dianas proteicas farmacológicas.

La caracterización biofísica de una proteína proporciona:

– Información sobre el paisaje conformacional. El paisaje conformacional es el conjunto de estados conformacionales, estructural y energéticamente distinguibles, que son accesibles y se pueblan significativamente. La distribución de moléculas sobre estos estados conformacionales depende de la energía de Gibbs de cada estado, que es una función de las variables externas (temperatura, pH, fuerza iónica…) y de la interacción con otras biomoléculas o mutaciones en la secuencia. Como cada estado conformacional puede exhibir propiedades funcionales particulares, la conformación y la función de una proteína están reguladas a través de cambios en las variables externas y de señalización bioquímica (presencia de biomoléculas interaccionantes) o mutaciones. Esta conexión entre conformación y fucnión constituye la base del comportamiento alostérico en proteínas: modulación y control de la conformación (y, por tanto, de la función) mediante interacciones con otras biomoléculas (ej. iones, cofactores, inhibidores…).

Nosotros empleamos técnicas y métodos biofísicos para estudiar el paisaje conformacional de proteínas de interés biotecnológico y/o biomédico.

– Información sobre la función, regulación y evolución. La función fisiológica de proteínas, así como su regulación, siempre depende de la interacción con otras moléculas. Por tanto, la caracterización estructural y energética detallada de sus interacciones es fundamental. La interacción con iones metálicos estructurales y cofactores es de especial interés para la regulación de la función de proteínas. Además, esta información puede esclarecer aspectos evolutivos: la estabilización de estados conformacionales y funcionales alternativos inducida por mutaciones o ligandos puede originar nuevas funciones.

Nosotros empleamos técnicas y métodos biofísicos para estudiar interacciones y su relación con la estabilidad estructural, así como su influencia sobre el paisaje conformacional.

– Información sobre las bases moleculares y energéticas de enfermedades. Proteínas defectuosas son causa frecuente de enfermedad. La estabilización de estados non-nativos parcialmente (o completamente) desplegados inducida por mutaciones o ligandos puede conducir a un plegamiento incorrecto, inactivación y/o degradación temprana de una proteína, o a la formación de agregados tóxicos. Del mismo modo, mutaciones pueden alterar o impedir interacciones requeridas para una correcta función. El estudio biofísico del paisaje conformacional proporciona información sobre los estados conformacionales que podrían ser relevantes, en relación con la función y su regulación, así como información sobre el impacto de mutaciones sobre dicha función.

Nosotros empleamos técnicas y métodos biofísicos para evaluar el impacto de mutaciones y la interacción con ligandos sobre la estabilidad y función de dianas farmacológicas.

– Información para establecer estrategias de identificación de compuestos bioactivos. Tanto en enfermedades infecciosas (en las que la inactivación de una proteína clave del ciclo vital del patógeno mediante un inhibidor es la estrategia terapéutica usual) como en enfermedades genéticas o metabólicas (en las que la inactivación de una actividad excesiva mediante un inhibidor o el rescate de una actividad defectuosa con una chaperona farmacológica representan estrategias terapéuticas alternativas), es necesario modular y controlar la función de una determinada proteína. Para conseguir ese objetivo es necesario identificar compuestos de bajo peso molecular: 1) capaces de interaccionar con la proteína; 2) capaces de modular la función de la proteína; 3) que no interaccionen con dianas secundarias minimizando así los efectos secundarios; y 4) que tengan un perfil farmacocinético (ADMET) óptimo. La caracterización biofísica de una proteína proporciona información relevante sobre los puntos 1-3, representando un elemento crucial para el diseño, la validación y la optimización de procedimientos de cribado molecular.

Nosotros desarrollamos e implementamos procedimientos de cribado molecular de alto rendimiento para identificar compuestos bioactivos frente a dianas farmacológicas.

– Información para optimizar compuestos bioactivos (afinidad, selectividad, cambios conformacionales inducidos…). El estudio biofísico de interacciones en proteínas proporciona información sobre las interacciones intermoleculares relevantes (enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, electrostáticas e hidrofóbicas) subyacentes. La disección termodinámica de una interacción permite estimar las contribuciones entálpica y entrópica a la energía de Gibbs de interacción. El reparto de la energía de Gibbs en sus términos entálpico y entrópico (perfil o firma termodinámica de interacción) es fundamental para describir dicha interacción, ya que estos términos energéticos reflejan interacciones intermoleculares de diferente naturaleza (fortaleza, especificidad, susceptibilidad a mutaciones y facilidad para rediseño). Ligandos de similar afinidad interaccionan de forma diferente y exhiben diferentes propiedades si presentan un perfil termodinámico de interacción diferente; en particular, su interacción estará dirigida por diferentes interacciones intermoleculares, mostrarán diferente susceptibilidad frente a mutaciones en la diana, e inducirán diferentes cambios conformacionales. Por tanto, no solo la afinidad de interacción, sino el perfil termodinámico completo es relevante para comprender el modo de interacción y como criterio de decisión clave en la optimización de la afinidad y selectividad de interacción.

Nosotros desarrollamos e implementamos procedimientos para la caracterización de interacciones biomoleculares. La caracterización biofísica termodinámica de compuestos candidato proporciona información valiosa para su optimización.

Los fenómenos cooperativos son inherentes al comportamiento de las biomoléculas y constituyen la base molecular y energética para la regulación de proteínas y el comportamiento alostérico. Se pueden distinguir diferentes tipos o niveles de cooperatividad en biomoléculas, que están a su vez directamente relacionados:

– Estabilidad intrínseca de proteínas. El paisaje conformacional y las características estructurales y energéticas intrínsecas de una proteína son determinantes clave de su comportamiento y función. Muchas proteínas se pliegan espontáneamente y adoptan un estado nativo estructurado y definido. Otras proteínas pueden poblar estados parcialmente plegados non nativos con relevancia biológica. Además, muchas proteínas no se pliegan formando un estado conformacional estructurado a menos que interaccionen con otra molécula (proteínas intrínsecamente desordenadas), lo que puede tener implicaciones relacionadas con su función y regulación. Sorprendentemente, el aisaje conformacional y la estabilidad estructural intrínseca no se conservan entre proteínas estructuralmente homólogas.

Nosotros estudiamos la estabilidad estructural de proteínas, con particular interés en proteínas intrínsecamente (parcialmente) desplegadas.

– Acoplamiento entre interacción y cambios conformacionales. Frecuentemente las interacciones con ligandos en proteínas están acompañadas de cambios conformacionales. Esto es un reflejo de la modulación del paisaje conformacional mediante la interacción con un ligando. La magnitud del cambio conformacional depende de muchos factores; en particular, de la estabilidad intrínseca de la proteína y de características estructurales y funcionales específicas del ligando. Por ejemplo, se ha comprobado que en un ligando los determinantes estructurales para la afinidad de interacción no coinciden necesariamente con los determinantes para la regulación alostérica (que se produce mediante cambios conformacionales acoplados a la interacción). De hecho, el ajuste inducido se puede considerar un caso límite de selección conformacional cuando existe una diferencia de energía de Gibbs muy grande entre los dos estados conformacionales interconectados mediante la unión de ligando.

Nosotros estudiamos los cambios conformacionales acoplados a la interacción de ligandos en proteínas, así como la relación entre plegamiento y unión en la regulación de la función en proteínas y en la especificidad de interacción.

– Cooperatividad de interacción. La cooperatividad homotrópica (cooperatividad de unión entre moléculas del mismo ligando interaccionando con varios sitios de una proteína) y cooperatividad heterotrópica (cooperatividad de unión entre moléculas de diferentes ligandos interaccionando con uno o varios sitios de una proteína) constituyen la base de la regulación de la función de las proteínas y el comportamiento alostérico. En un sentido general, alosterismo se puede definir como el control y la modulación de la conformación de una proteína (paisaje conformacional) mediante la interacción con ligandos. Por tanto, cualquier proteína puede ser considerada una proteína alostéricamente regulada. El ejemplo más conocido es la dependencia con el pH de la estabilidad estructural de una proteína o la afinidad de interacción con un ligando: la unión o disociación de protones en grupos funcionales ionizables de la proteína (o el ligando) altera la energética de desplegamiento o de interacción. Por tanto, la afinidad de interacción, la cooperatividad de interacción y la capacidad de control alostérico no son propiedades conservadas entre ligandos estructuralmente similares.

Nosotros desarrollamos e implementamos metodologías para caracterizar y evaluar efectos cooperativos (homotrópicos y heterotrópicos) en proteínas y su conexión con la función biológica.

PUBLICACIONES RELEVANTES

1.- J.L. Neira, J. Bintz, M. Arruebo, B. Rizzuti, T. Bonacci, S. Vega, A. Lanas, A. Velazquez-Campoy, J.L. Iovanna, O. Abian. Identification of a drug targeting an intrinsically disordered protein involved in pancreatic adenocarcinoma. Scientific Reports 2017 7:39732

2.- R. Claveria-Gimeno, P.M. Lanuza, I. Morales-Chueca, O.C. Jorge, S. Vega, O. Abian, M. Esteller, A. Velazquez-Campoy. The intervening domain from MeCP2 enhances the DNA affinity of the methyl binding domain and provides an independent DNA interaction site. Scientific Reports 2017 7:41635

3.- Biophysical screening for identifying pharmacological chaperones and inhibitors against conformational and infectious diseases. Velazquez-Campoy, J. Sancho, O. Abian, S. Vega. Current Drug Targets 2016 17:1492-1505.

4.- R. Sant’Anna, P. Gallego, L. Robinson, A. Pereira, Ne. Ferreira, F. Pinheiro, S. Esperante, I. Pallares, O. Huerta, R. Almeida, N. Reixach, R. Insa, A. Velazquez-Campoy, D. Reverter, N. Reig, S. Ventura. Repositioning Tolcapone as a potent inhibitor of transthyretin amyloidogenesis and associated cellular toxicity. Nature Communications 2016 7:10787.

5.- S. Vega, O. Abian, A. Velazquez-Campoy. A unified framework based on the binding polynomial for characterizing biological systems by isothermal titration calorimetry. Methods 2015, 76:99-115

6.- R.M. Buey, R. Ledesma-Amaro, A. Velazquez-Campoy, M. Balsera, M. Chagoyen, J.M. de Pereda, J.L. Revuelta. Guanine nucleotide binding to the Bateman domain mediates the allosteric inhibition of eukaryotic IMP dehydrogenases. R.M. Buey, R. Ledesma-Amaro, A. Velazquez-Campoy, M. Balsera, M. Chagoyen, J.M. de Pereda, J.L. Revuelta. Nature Communications 2015 6:8923.

7.- K. Gonzalez-Arzola, I. Diaz-Moreno, A. Cano-Gonzalez, A. Diaz-Quintana, A. Velazquez-Campoy, B. Moreno-Beltrán, A. Lopez-Rivas, M.A. De la Rosa. Structural basis for inhibition of the histone chaperone activity of SET/TAF-Iβ by cytochrome c.  Proceedings of the National Academy of Sciences USA 2015 112:9908-9913.

8.- J.J. Galano, M. Alias, R. Perez, A. Velazquez-Campoy, P.S. Hoffman, J. Sancho. Improved flavodoxin inhibitors with potential therapeutic effects against Helicobacter pylori infection. Journal of Medicinal Chemistry 2013 56:6248-6258.

9.- O. Abian, S. Vega, J. Sancho, A. Velazquez-Campoy. Allosteric inhibitors of the NS3 protease from the hepatitis C virus. PLoS ONE 2013 8:e69773.

10.- S. Chopra, A. Palencia, C. Virus, A. Tripathy, B.R. Temple, A. Velazquez-Campoy, S. Cusack, J.S. Reader. Plant tumour biocontrol agent employs a tRNA-dependent mechanism to inhibit leucyl-tRNA synthetase. Nature Communications 2013 4:1417.

11.- P.T. Martins, A. Velazquez-Campoy, W.L. Vaz, R.M. Cardoso, J. Valerio, M.J. Moreno. Kinetics and thermodynamics of chlorpromazine interaction with lipid bilayers: Effect of charge and cholesterol. Journal of the American Chemical Society 2012 134:4184-4195.

12.- O. Abian, S. Vega, J.L. Neira, A. Velazquez-Campoy. Conformational stability of hepatitis C virus NS3 protease. Biophysical Journal 2010 99:3811-3820.

13. N. Cremades, A. Velazquez-Campoy, M. Martinez-Julvez, J.L. Neira, I. Perez-Dorado, J. Hermoso-Dominguez, P. Jimenez, A. Lanas, P.S. Hoffman, J. Sancho. Discovery of specific flavodoxin inhibitors as potential therapeutic agents against Helicobacter pylori infection. ACS Chemical Biology 2009 4:928-938.

14.- O. Abian, J.L. Neira, A. Velazquez-Campoy. Thermodynamics of zinc binding to hepatitis C virus NS3 protease: A folding by binding event. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 2009 77:624-636.

15.- A.L. Pey, M. Ying, N. Cremades, A. Velazquez-Campoy, T. Scherer, B. Thöny, J. Sancho, A. Martinez. Identification of pharmacological chaperones as new therapeutic agents to treat phenylketonuria. Journal of Clinical Investigation 2008 118:2858-2867.

PRINCIPALES PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

1.- Structure, energetics, and simulation of (partially) unfolded conformations in proteins. Towards quantitative atomic models for the protein stability. Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2016-78232-P). 2016-2019. PI: Adrián Velázquez Campoy / Javier Sancho (co-IPs) (Universidad de Zaragoza – BIFI).

2.- New infrastructure for the Laboratorio Avanzado de Cribado e Interacciones Moleculares de Aragon (LACRIMA). Diputación General de Aragón y Ministerio de Economía y Competitividad (Proyecto de Infraestructuras Científico-Tecnológicas UNZA15-EE-3250). Universidad de Zaragoza. 2016-2018. PI: Javier Sancho (Universidad de Zaragoza – BIFI).

3.- Between atom and cell: Integrating molecular biophysics approaches for biology and healthcare (MOBIEU). European Cooperation in Science and Technology (eCOST, COST Action CA15126). ARBRE (Association of Resources for Biophysical Research in Europe). 2016-2020. PI: Patrick England (Institute Pasteur). Adrián Velázquez-Campoy (Management Committee).

4.- Validation of a new, quick, non-invasive diagnostic method in serum for early detection of pancreatic cancer (PANCal). Asociación Española de Gastroenterología – Club Español del Páncreas. Instituto Investigación Sanitaria de Aragón, Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Hospital Universitario Miguel Servet, Hospital de Donosti, Hospital de Barbastro, Universidad de Zaragoza – Instituto BIFI. 2015. PI: Olga Abián (Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón (IIS) – Universidad de Zaragoza – BIFI).

5.- Protein stability: Basic principles of (partially) unfolded states and molecular studies on conformational disorders. Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2013-47064-P). Universidad de Zaragoza. 2014-2017. PI: Adrián Velázquez Campoy / Javier Sancho (co-IPs) (Universidad de Zaragoza – BIFI).

6.- NEUROMED – Diagnosis and treatment of three neurodegenerative diseases (Parkinson, Phenylketonuria and TTR amyloidosis). ERDF – SUDOE Interreg IVB (SOE4/P1/E831 – Neuromed). Universidad de Zaragoza, Universidad Autónoma de Barcelona, Instituto de Biologia Molecular e Celular (Porto), Universidade de Coimbra, CNRS, INSERM (Languedoc-Roussillon). 2014-2015. PI: Javier Sancho (Universidad de Zaragoza – BIFI).

7.- Bioavailability of amphiphilic ligands – Drugs and metabolites. Ministerio de Ciencia e Innovación (Proyectos de Movilidad – Acciones Integradas, PRI-AIBPT-2011-1025). Universidad de Zaragoza, Universidad de Coimbra. 2012-2013. PI: Adrián Velázquez Campoy (Universidad de Zaragoza – BIFI).

8.- NS3 protease from hepatitis C virus: Identification of competitive and allosteric inhibitors. Ministerio de Ciencia e Innovación (BFU2010-19451). Universidad de Zaragoza. 2010-2013. PI: Adrián Velázquez Campoy (Universidad de Zaragoza – BIFI).

9.- NS3 protease from hepatitis C virus: Competitive and allosteric inhibitors, and molecular basis of drug resistance. Universidad de Zaragoza (UZ2009-BIO-05). Universidad de Zaragoza. 2010. PI: Adrián Velázquez Campoy (Universidad de Zaragoza – BIFI).

10.- Conformational equilibrium of the NS3 protease from hepatitis C virus: Non-native states and identification of a new type of allosteric inhibitors. Diputación General de Aragón (PI044/09). Universidad de Zaragoza. 2009-2011. PI: Adrián Velázquez Campoy (Universidad de Zaragoza – BIFI).

Colaboradores

• Olga Abian (Instituto Aragones de Ciencias de la Salud and BIFI, Spain)
• Juan Ausio (University of Victoria, Canada)
• Rui Brito (Universidade de Coimbra, Portugal)
• Pierpaolo Bruscolini (Universidad de Zaragoza and BIFI, Spain)
• Jose A. Carrodeguas (Universidad de Zaragoza and BIFI, Spain)
• Irene Diaz-Moreno (Instituto de Bioquimica Vegetal y Fotosintesis – CSIC, Spain)
• Maria Fillat (Universidad de Zaragoza and BIFI, Spain)
• Marcos R. Fontes (São Paulo State University, Brazil)
• Ernesto Freire (The Johns Hopkins University, USA)
• Enrique Garcia-Hernandez (Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexico)
• Ruben Martinez-Buey (Universidad de Salamanca, Spain)
• Milagros Medina (Universidad de Zaragoza and BIFI, Spain)
• Maria João Moreno (Universidade de Coimbra, Portugal)
• Arturo Muga (Universidad del Pais Vasco, Spain)
• Jose A. Navarro (Instituto de Bioquimica Vegetal y Fotosintesis – CSIC, Spain)
• Julian Pardo (Universidad de Zaragoza and IIS-Aragon, Spain)
• Santiago Ramon-Maiques (CNIO, Spain)
• David Reverter (Universidad Autonoma de Barcelona, Spain)
• Javier Sancho (Universidad de Zaragoza and BIFI, Spain)
• Jayaraman Sivaraman (National University of Singapore, Singapore)
• Maria A. Urbaneja (Universidad del Pais Vasco, Spain)
• Salvador Ventura (Universidad Autonoma de Barcelona, Spain)

La Glicosilación de Proteínas y su Papel en Enfermedad

Responsable de la Línea de Investigación:

Ramón Hurtado Guerrero

Investigadores:

• Ana García García
• Javier Macías León
• Andrés Manuel González Ramírez
• Víctor Taleb
• Erandi Lira Navarrete

RESUMEN

Nuestro grupo está interesado en el estudio de las glicosiltransferasas, glicosilhidrolasas y proteínas/módulos de unión a carbohidratos implicados en enfermedades humanas. Para ello, utilizamos la cristalografía de proteínas como la principal herramienta complementada con enzimología, estudios de inhibición, etc, con el fin de estudiar los mecanismos moleculares de las enzimas que están implicadas en la síntesis, modificación y degradación de los glicoconjugados, oligo y polisacáridos (ver las publicaciones más relevantes del grupo a continuación).

 Principalmente trabajamos actualmente en la O-glicosilación de proteínas y en las glicosiltransferasas responsables de esta modificación postraduccional.

En particular, actualmente estamos trabajando en varias glicosiltransferasas como las Proteínas O-fucosiltransferasas 1 y 2 (POFUT1 y 2), FUT8 y la gran familia de GalNAc-Ts. Mientras que POFUT1 y 2 fucosilatan dominios plegados como los dominios EFG y TSR, respectivamente, GalNAc-Ts glicosilan principalmente regiones no estructuradas presentes en un gran número de proteínas como las mucinas. FUT8 es responsable de la llamada fucosilación del núcleo (Figura 1).

Figure 1. Scheme summarizing the structure of FUT8 complexed to GDP and a biantennary N-glycan..

Además estamos interesados ​​en la elucidación de las coordenadas de reacción y el mecanismo catalítico mediante el uso de análogos de estado de transición o complejos de Michaelis. Finalmente estos estudios serán importantes para el diseño de nuevos fármacos con futuras aplicaciones terapéuticas frente a diversas enfermedades.

Por ultimo y aunque no relacionado con el campo de la glicobiología, tenemos una estrecha colaboración con el Prof. Dr. Guadix y Conejo-García, de la Universidad de Granada, en el desarrollo de nuevos inhibidores contra la colina quinasa a1 humana para el tratamiento del cáncer.

PUBLICACIONES RELEVANTES

1.- Structural insights into mechanism and specificity of O-GlcNAc transferase. Clarke AJ*, Hurtado-Guerrero R*, Pathak S*, Schüttelkopf AW*, et al. EMBO J. 2008, 27(20): 2780-8. *equal contributation as first author.

2.- Molecular mechanisms of O-GlcNAcylation. Hurtado-Guerrero R, Dorfmueller HC, van Aalten DM. Curr Opin Struct Biol. 2008, 18(5): 551-7.

3.- Recent structural and mechanistic insights into post-translational enzymatic glycosylation. Ramon Hurtado-Guerrero* and Gideon J Davies. Current Opinion in Chemical Biology. 16(5-6):479-87, 2012. *corresponding author

4.- The Vibrio cholerae colonization factor GbpA possesses a modular structure that governs binding to different host surfaces. Wong E, Vaaje-Kolstad G, Ghosh A, Ramon Hurtado-Guerrero, et al. PLoS Pathogen, 2012.

5.- The mechanism of allosteric coupling in choline kinase α1 revealed by a rationally designed inhibitor. María Sahún-Roncero, Belén Rubio-Ruiz, Giorgio Saladino, Ana Conejo-García, Antonio Espinosa, Adrián Velázquez-Campoy, Francesco Luigi Gervasio, Antonio Entrena and Ramon Hurtado-Guerrero*. Angewandte Chemie (selected as VIP), 52(17):4582-6, 2013. *corresponding author

6.- Combined structural snapshots and metadynamics reveal a substrate-guided front-face reaction for polypeptide GalNAc-transferase T2. Erandi Lira-Navarrete, Javier Iglesias-Fernández, Wesley F. Zandberg, Ismael Compañón, Yun Kong, Francisco Corzana, B. Mario Pinto, Henrik Clausen, Jesús M. Peregrina, David Vocadlo, Carme Rovira* and Ramon Hurtado-Guerrero*. Angewandte Chemie International Edition, 53(31):8206-10, 2014. *corresponding author

7.- Dynamic interplay between catalytic and lectin domains of GalNAc transferases modulates protein O-glycosylation. Erandi Lira-Navarrete, Matilde de las Rivas, Ismael Compañón, María Carmen Pallarés, Yun Kong, Javier Iglesias-Fernández, Gonçalo J. L. Bernardes, Jesús M. Peregrina, Carme Rovira, Pau Bernadó, Pierpaolo Bruscolini, Henrik Clausen, Anabel Lostao, Francisco Corzana, and Ramon Hurtado-Guerrero*. Nature Communications, 5;6:6937, 2015. *corresponding author

8.- X-ray Structures decipher the Non-equivalence of Serine and Threonine O-glycosylation points: Implications for the Molecular Recognition of the Tn Antigen by an anti-MUC1 Antibody. Nuria Martínez-Sáez,‡ Jorge Castro-López,‡ Jessika Valero-González,‡ David Madariaga, Ismael Compañón, Víctor J. Somovilla, Míriam Salvadó, Juan L. Asensio, Jesús Jiménez-Barbero, Alberto Avenoza, Jesús H. Busto, Gonçalo J. L. Bernardes, Jesús M. Peregrina,* Ramón Hurtado-Guerrero,* and Francisco Corzana*. Angewandte Chemie International, 54(34):9830-9834, 2015. *corresponding author

9.- Mucin Architecture behind the Immune Response: Design, Evaluation and Conformational Analysis of an Antitumor Vaccine Derived from an Unnatural MUC1 Fragment. Martínez-Sáez N, Supekar NT, Wolfert MA, Bermejo IA, Hurtado-Guerrero R, Asensio JL, Jiménez-Barbero J, Busto JH, Avenoza A, Boon G-J, Peregrina JM, and Corzana F. Chemical Science, 2016. DOI: 10.1039/C5SC04039F

10.- A proactive role of water molecules in acceptor recognition by Protein-O-fucosyltransferase 2. Jessika Valero-González, Christina Leonhard-Melief , Erandi Lira-Navarrete, Gonzalo Jiménez-Osés, Cristina Hernández-Ruiz, María Carmen Pallarés, Inmaculada Yruela, Deepika Vasudevan, Anabel Lostao, Francisco Corzana, Hideyuki Takeuchi, Robert S. Haltiwanger, and Ramon Hurtado-Guerrero*. Nature Chemical Biology, accepted manuscript, 2016. DOI:10.1038/nchembio.2019. * corresponding author

11.- A trapped covalent intermediate of a glycoside hydrolase on the pathway to transglycosylation. Insights from experiments and QM/MM simulations. Lluís Raich, Vladimir Borodkin, Wenxia Fang, Jorge Castro-López, Daan van Aalten*, Ramon Hurtado-Guerrero* and Carme Rovira*. Journal of the American Chemical Society (JACS), 2016. DOI: 10.1021/jacs.5b10092. * corresponding authors

12.- The interdomain flexible linker of the polypeptide GalNAc transferases (GalNAc-Ts) dictates their long-range glycosylation preferences. Matilde de las Rivas, Erandi Lira-Navarrete, et al., and Ramon Hurtado-Guerrero*.Nature Communications, 2017. DOI: 10.1038/s41467-017-02006-0. *corresponding author.

13.- The use of fluoroproline in MUC1 antigen enables efficient detection of antibodies in patients with prostate cancer. Somovilla Víctor, et al., Hurtado-Guerrero Ramon, et al., Corzana Francisco. JACS, 2017. DOI:10.1021/jacs.7b09447.

14.– Water Sculpts the Distinctive Shapes and Dynamics of the Tn Antigens: Implications for their Molecular Recognition. Iris A. Bermejo, et al., Ramón Hurtado-Guerrero*. JACS, 2018 DOI: 10.1021/jacs.8b04801. *corresponding authors.

15.- Dynamic acetylation of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase toggles enzyme activity between gluconeogenic and anaplerotic reactions. Pedro Latorre-Muro, Josue Baeza, Eric A. Armstrong, Ramón Hurtado-Guerrero, et al., José A. Carrodeguas* and John M. Denu*. Molecular Cell, 2018, just accepted. Authors.

16.- Structural basis for arginine glycosylation of host substrates by bacterial effector proteins. Jun Bae Park, Young Hun Kim, Youngki Yoo, Juyeon Kim, Sung-Hoon Jun, Jin Won Cho, Samir El Qaidi, Samuel Walpole, Serena Monaco, Ana A. García-García, Miaomiao Wu, Michael P. Hays, Ramon Hurtado-Guerrero*, Jesus Angulo*, Philip R. Hardwidge, Jeon-Soo Shin* and Hyun-Soo Cho*. Nature Communications, 2018, just accepted. *joint corresponding authorship.

17.- Structural and mechanistic insights into the catalytic domain-mediated short-range glycosylation preferences of GalNAc-T4. de las Rivas Matilde, Paul Daniel Earnest James, Coelho Helena, Lira-Navarrete Erandi, Raich Lluís, Companon Ismael, Diniz Ana, Lagartera Laura, Jiménez-Barbero Jesús, Clausen Henrik, Rovira Carme, Marcelo Filipa, Corzana Francisco, Gerken Thomas* and Hurtado-Guerrero, Ramón*. ACS Central Science, 2018, just accepted. *joint corresponding authorship.

18. Polypeptide GalNAc-Ts: from redundancy to specificit. de las Rivas Matilde, Lira-Navarrete, Erandi, Gerken Thomas* and Hurtado-Guerrero, Ramon*. . Current Opinion in Structural Biology, 2019. doi: 10.1016/j.sbi.2018.12.007 *joint corresponding authorship.

19. Structure-based design of potent tumor-associated antigens: modulation of peptide presentation by single atom O/S or O/Se substitutions at the glycosidic linkage. Compañón Ismael, Guerreiro Ana, Mangini Vincenzo Castro-López Jorge, Escudero-Casao Margarita, Avenoza Alberto, Busto Jesús, Castillón Sergio, Jiménez-Barbero Jesús, Asensio Juan, Jiménez-Osés Gonzalo, Boutureira Omar, Peregrina Jesús, Hurtado-Guerrero Ramón, Fiammengo Roberto, Bernardes Gonçalo and Corzana Francisco. . JACS, 2019. doi: 10.1021/jacs.8b13

20. Mechanisms of redundancy and specificity of the Aspergillus fumigatus Crh transglycosylases. Fang Wenxia, Sanz Ana Belén, Galan Bartual Sergio, Wang Bin, Ferenbach Andrew, Farkaš Vladimír, Hurtado-Guerrero Ramon, Arroyo Javier and van Aalten DMF.  Nature Communications, 2019. doi: 10.1038/s41467-019-09674-0

21. Molecular basis for Fibroblast growth factor 23 (FGF23) O-glycosylation and regulation by polypeptide GalNAc-T3. Matilde de las Rivas, Earnest Daniel, Yoshiki Narimatsu, Ismael Compañón, Kentaro Kato, Pablo Hermosilla, Aurélien Thureau, Laura Ceballos-Laita, Helena Coelho, Pau Bernado, Filipa Marcelo, Lars Hansen, Ryota Maeda, Anabel Lostao, Francisco Corzana, Henrik Clausen, Thomas Gerken and Ramón Hurtado-Guerrero*.  Nature Chemical Biology, 2020. doi: 10.1038/s41589-019-0444-x * corresponding autor.

22. Structural basis for substrate specificity and catalysis of α1,6-fucosyltransferase. Ana García-García, Laura Ceballos-Laita, Sonia Serna, Raik Artschwager, Niels C. Reichardt, Francisco Corzana and Ramon Hurtado-Guerrero*. Just accepted in Nature Communications, 2020. doi: 10.1038/s41467-020-14794-z. * corresponding autor.

23. Recent advances in the design of Choline kinase α inhibitors and the molecular basis of their inhibition. Belén Rubio-Ruiz, Lucía Serán-Aguilera, Ramón Hurtado-Guerrero*, and Ana Conejo-García*.  Medicinal Research Reviews. doi: 10.1002/med.21746. *Joint corresponding authorship

PRINCIPALES PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

1.- Study of glycosyltransferases involved in the Notch signalling pathway
MICINN, 2011-2014. 120,000 euros. PI: Ramón Hurtado-Guerrero

2.- Study of protein-carbohydrate interactions involved in human diseases. MEC, 2014-2016. 76,000 euros. PI: Ramón Hurtado-Guerrero

3.- BFU2016-75633-P (MICINN), 2017-2019. 220,000 euros plus extra funding for one PhD student. PI: Ramón Hurtado-Guerrero

4.- FEDER proyects for infrastructure and in particular for LACRIMA (2016-2017). UNZA15-EE-3250. PI: Javier Sancho. coPIs: Ramón Hurtado-Guerrero and others. 386,872 euros

5.- FEDER proyects for infrastructure and in particular for the adquistion of a FRET machine (2016-2017). UNZA15-EE-2922. PI: Nunilo Cremades. coPIs: Ramón Hurtado-Guerrero and others. 323,049 euros

6.- Crowdfunding for development of antifungal drugs. PI: Ramón Hurtado-Guerrero. 6600 euros, 2018-2019.

7.- Collaborative research network in Glycobiology “GLYCOBIOCHEM”. CTQ2017-90719-REDT. PI: Niels Reichardt, coPI: Ramón Hurtado-Guerrero and others. 17,000 euros, 01072018-30062020.

8.- DGA Group. Chemical Biology and Computation. E34_17R. PI: Pedro Merino, coPI: Ramón Hurtado-Guerrero. 45,971 euros, 2018-2019.

9.- Bases moleculares de la O-glicosilación tipo mucina y su aplicación en el tratamiento de tumores. LMP58_18 (DGA). 85,500 euros, 2019-2020. PI: Ramón Hurtado-Guerrero

10.- FEDER proyect for infrastructure (EQC2019-005847-P). Implementation of complex cellular models for drug discovery: Advanced equipment for the production, purification and analysis of proteins. PI: Milagros Medina. coPIs: Ramón Hurtado-Guerrero and others. 463,086.87 euros (2017-2020).

11.- Desarrollo de nanobodies y “adhirons” frente al dominio de unión de la glicoproteína “spike” del virus SARS-CoV-2 como tratamiento para la enfermedad CoVid19. DGA, 275,000 euros, 2020-2021. PI: Ramón Hurtado-Guerrero, coPI: Julián Pardo

12.- Desarrollo y validación de un test de inmunocromatografía para su aplicación en el diagnóstico serológico frente a SARS‐CoV‐2 en animales de compañía. Proyecto Santander-Unizar. 8500 euros, 2020-2021. PI: Pérez Cabrejas, M. Dolores, coPI among others: Ramón Hurtado-Guerrero.

13.- PID2019-105451GB-I00 (MICINN), 2020-2022. 266,200 euros plus extra funding for one PhD student. PI: Ramón Hurtado-Guerrero

14. Collaborative research network in Glycobiology “GLYCOBIOCHEM”. CTQ2017-90719-REDT. PI: Niels Reichardt, coPI: Ramón Hurtado-Guerrero and others. 17,000 euros, 01072018-30062020.

15.- COST “Innogly”. PI: Luigi Lay, coPIs: Ramón Hurtado-Guerrero and others. 2019-2022

Colaboradores

• Robert Haltiwanger, The University of Georgia
• Henrik Clausen, University of Copenhagen
• Daan van Aalten, University of Dundee
• Philip Hardwidge, Kansas State University
• Tom Gerken, Case Western Reserver University
• Pedro Merino, Universidad de Zaragoza
• Francisco Corzana, Universidad de La Rioja
• Carme Rovira, Universidad de Barcelona
• Filipa Marcelo, New University of Lisbon
• Julián Pardo, Universidad de Zaragoza
• Anabel Lostao, Universidad de Zaragoza

Flavoenzimas: Mecanismos de Acción y Biotecnología

Responsable de la Línea de Investigación:

Dr. Milagros Medina

Investigadores:

Dr. Marta Martínez Júlvez
Dr. Patricia Ferreira Neila
Silvia Romero Tamayo
Martha Minjárez Sáenz
Nerea Novo Huerta
Sergio Boneta Martinez
Andrea Moreno Maldonado
Olga Arjona

RESUMEN

Las flavoenzimas son biomoléculas versátiles y diversas que contribuyen a mantener y construir estructuras celulares, a mover moléculas entre compartimentos celulares, a eliminar toxinas, a facilitar las transformaciones químicas en las vías biosintéticas, a la vez que se encargan particularmente de la bioenergética y la señalización celular. Tienen como cofactores los derivados de riboflavina (RF, vitamina B2), mononucleótido de flavina (FMN) y / o dinucleótido de flavina y adenina (FAD), que les confieren propiedades únicas y versátiles. Todos los organismos contienen flavoproteínas y flavoenzimas clave, y muchas de ellas se han convertido en interesantes dianas terapéuticas o herramientas biotecnológicas. El conocimiento de sus mecanismos como base para potenciar sus aplicaciones biotecnológicas es el principal objetivo del grupo «Flavoenzimas: mecanismos de acción y biotecnología».

Nuestra hipótesis de trabajo es que necesitamos comprender los mecanismos moleculares de las flavoenzimas con funciones metabólicas clave en bacterias, parásitos, plantas o animales, con el fin de explotar su potencial en varias áreas de la biotecnología. En nuestro grupo aplicamos una combinación interdisciplinar de herramientas de bioquímica, biofísica, biología celular y biología computacional con el fin de investigar los mecanismos y factores que aportan versatilidad a varios sistemas dependientes de flavoenzimas, y utilizar esta información en nuevas aplicaciones biotecnológicas y terapéuticas.  Las publicaciones del grupo reflejan nuestras contribuciones en áreas clave en la comprensión de las flavoenzimas. Dado el amplio abanico de intereses y metodologías en nuestra investigación, mantenemos estrechas colaboraciones con especialistas en otras disciplinas, tanto dentro de BIFI y UNIZAR, como de instituciones externas.

FLAVOENZIMAS HUMANAS EN SALUD Y ENFERMEDAD: EL FACTOR INDUCTOR DE APOPTOSIS HUMANA (AIF)

El cuerpo humano utiliza más de 80 flavoenzimas que realizan funciones muy diferentes. Si se produce un error, una mutación, en uno de ellos, ésta puede afectar de forma aberrante su actividad, estabilidad y/o interacción con otras biomoléculas, alterando las funciones celulares. Dos tercios de las proteínas humanas dependientes de flavina están asociadas con trastornos causados ​​por variantes alélicas, lo que hace interesante el desarrollo de moléculas capaces de rescatar la conformación y función nativas. Para tratar la causa de estas enfermedades, es aconsejable el uso de terapias moleculares personalizadas capaces de rescatar cada variante de funcionalidad. La implementación de tales acciones requiere la comprensión previa de las relaciones entre los mecanismos patológicos y moleculares en los que participa la proteína. La familia de AIF humana (AIF) consta de tres flavoproteínas que tienen en común: i) la localización mitocondrial, ii) los dominios de oxidorreductasa dependientes de FAD y NADH involucrados en una función oxidorreductasa -aunque aún no bien comprendida- y iii) una actividad que induce de apoptosis.

El miembro más representativo es AIF1, o simplemente AIF, que es una flavoenzima mitocondrial conservada filogenéticamente que comparte homología con diferentes familias de reductasas. En mitocondrias intactas, AIF exhibe actividad NADH-óxidoreductasa a través de su cofactor flavina, FAD, que se ha relacionado con la estabilidad y biogénesis de los complejos respiratorios I y III a través de la interacción con otras proteínas, como CHCHD4 (homólogo en humanos a MIA40). Sin embargo, actualmente no se comprenden ni su papel como reductasa ni los mecanismos moleculares que subyacen en la biogénesis de los complejos mitocondriales. Además, cuando las mitocondrias reciben un estímulo apoptótico, AIF se transloca al núcleo, donde interactúa con otras proteínas nucleares formando el “degradosoma” que induce la cromatinólisis. Asimismo, se ha descrito la implicación de mutaciones en la secuencia de AIF como responsables directas de diversos trastornos neurodegenerativos que conducen a una disminución de la eficiencia del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial.

Así, tanto el interés en el diseño de nuevas terapias para modular la apoptosis independiente de caspasas, como la comprensión de la base molecular de las patologías relacionadas con mutaciones únicas en AIF, ha aumentado en los últimos años. Esto ha convertido a AIF en una potencial diana para el tratamiento de alteraciones patológicas (cáncer o enfermedades degenerativas) en las que esta proteína provoca un defecto o un exceso de apoptosis, o altera la bioenergética mitocondrial. El estado redox de AIF influye en su conformación y en su equilibrio monómero-dímero y, por extensión, en su función proapoptótica porque estos factores modulan la interacción con otras proteínas.

Dado que una de las posibilidades de modular la actividad proapoptótica del AIF es la regulación de su actividad redox, es imperativo responder a múltiples preguntas relacionadas con el mecanismo y función celular de dicha actividad.

Nuestra investigación sobre la familia AIF tiene como objetivo proporcionar algunas de estas respuestas mediante la comprensión de los mecanismos moleculares vinculados a los procesos de óxido reducción y las consecuencias de su actividad redox en la interacción con sus proteínas asociadas en los diferentes compartimentos celulares donde se encuentra.

LAS FLAVOPROTEÍNAS DE BACTERIAS PATÓGENAS COMO POTENCIALES DIANAS ANTIMICROBIANAS.

Las bacterias patógenas suelen sobrevivir en nichos intracelulares privados de nutrientes cuando infectan células de mamíferos. Entre esos nutrientes se encuentra la RF, una vitamina precursora de FMN y FAD.

Así, las flavinas y lasflavoproteínas son componentes relevantes en la regulación de la fisiología bacteriana frente al estrés y en la biología de la infección y colonización de las células huésped, relacionando estrechamente el metabolismo de las flavinas de los patógenos con la supervivencia en situaciones de estrés oxidativo, condiciones microanaeróbicas o falta de nutrientes. Algunas flavoproteínas están involucradas en la interacción patógeno: célula huésped, o como fotorreceptores primarios en la respuesta de señalización de la bacteria contra el estrés. Los niveles de FMN libres de células también controlan la expresión de genes particulares a través de los “riboswitch” de FMN, mientras que muchos patógenos no pueden obtener FMN y FAD de su entorno. Por último, la mayoría de las características y mecanismos de las flavoproteínas son específicas de cada especie y el contenido de flavoproteínas parece muy divergente.

Estos hechos hacen que la homeostasis de las flavinas y los flavoproteomas bacterianos sean dianas interesantes para el desarrollo de quimioterapias con las que combatir las enfermedades infecciosas. En este contexto, es importante comparar flavoproteínas de diferentes especies con respecto al mecanismo de unión y reacción del ligando, porque, incluso cuando los sustratos son iguales, pueden prevalecer diferencias significativas. Esta flavoenzimología bacteriana comparativa ayudará en el desarrollo de antimicrobianos específicos de especies. En esta línea, nuestras investigaciones están contribuyendo también a identificar inhibidores potenciales de una bacteria reductasa fitopatógena, así como de las FAD sintasas (FADS) de Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis.

LA BIOSINTESIS DE FMN Y FAD Y SU DISTRIBUCIÓN A APOPROTEÍNAS CLIENTE

La biosíntesis de FMN y FAD, su homeostasis celular y su distribución a apoproteínas clientes son procesos críticos y coordinados para la eficiencia de la energética celular, siendo también de interés para su utilización sanitaria y / o biotecnológica (aportando FMN y FAD a flavoproteínas para su utilización como biocatalizadores heterogéneos y multifuncionales). Las FADS bacterianas tienen actividades ATP:riboflavina quinasa (RFK, producción de FMN) y ATP:FMN:adenililtransferasa (FMNAT, producción de FAD), que, como hemos demostrado, son llevadas a cabo por módulos de independientes de estas proteínas. En eucariotas,e stas dos actividades son catalizadas por dos enzimas independientes, conocidas como HsRFK y HsFADS en humanos. El módulo RFK bacteriano muestra homología secuencial y estructural con HsRFK, mientras que el módulo FMNAT no presenta similitud secuencial ni estructural con las proteínas que producen FAD en mamíferos. Se ha sugerido que las FADS/FMNATs de monofuncionales de mamífero actúan como chaperonas de la flavina, proporcionando interacción física con sus proteínas cliente. Esta posibilidad no se ha explorado en las FADS bacterianas bifuncionales, y no se sabe nada sobre HsRFK. Dado que el conocimiento de las bases moleculares de dicha canalización puede ser fundamental para lograr la identificación de moléculas que inhiben la producción de FMN y FAD, así como para modular positiva o negativamente su canalización a la proteína cliente, estamos utilizando diferentes proteínas humanas y bacterianas para abordar este tema.

COLABORACIONES ESTABLECIDAS SOBRE OTROS SISTEMAS DEPENDIENTES DE FLAVOENZIMAS

Reductasas bacterianas dependientes de FAD:  en colaboración con los grupos del Dr. E. Ceccarelli y la Dra. E. Orellano de la Universidad Nacional de Rosario, Argentina, estudiamos comparativamente enzimas bacterianas y plastídicas. Dado que en muchas bacterias estas enzimas son esenciales o están implicadas en la respuesta al estrés oxidativo, pueden tratarse como dianas farmacológicas interesantes para el tratamiento de infecciones causadas por patógenos. En colaboración con la Dra. M. Balsera del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Salamanca, estamos evaluando cinéticamente los mecanismos catalíticos de una variedad de tiorredoxinas reductasas bacterianas que controlan el estado redox de tiorredoxinas, proteínas de amplia presencia que regulan un espectro de enzimas mediante intercambio de ditiol-disulfuro.

Oxidorreductasas en el metabolismo humano: en colaboración con el Dr. A. Pey de la Universidad de Granada, estamos estudiando el mecanismo catalítico de la enzima antioxidante y asociada al cáncer NAD(H):quinona oxidorreductasa 1. Se están realizando estudios cinéticos para evaluar la dinámica conformacional y la cooperatividad funcional, así como para comprender mejor los efectos de las variantes de un solo aminoácido asociadas al cáncer y las modificaciones postraduccionales en esta proteína de alta relevancia en la progresión y el tratamiento del cáncer.

Deshidrogenasas y oxidasas: en colaboración con el Dr. Martínez, del Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, hemos descrito el mecanismo catalítico de la flavoenzima fúngica aril-alcohol oxidasa e identificado sus residuos clave. Esta enzima está involucrada en la degradación de la lignina y el uso de biomasa vegetal con fines biotecnológicos. Los estudios estructura-función realizados han permitido describir en detalle molecular su mecanismo estereoselectivo de oxidación de alcoholes aromáticos y aldehídos y explorar su potencial para la producción de enantiómeros o síntesis de biopolímeros de interés. En colaboración con la Dra. Nonato de la Universidade de São Paulo, Brasil, estamos caracterizando otras flavoenzimas de interés biomédico como la dihidroorotato deshidrogenasa de Leshmania major y la L-aminoácido oxidasa del veneno de serpiente.

Además, también mantenemos colaboraciones específicas con diversos grupos con actividad en el campo de las flavoenzimas para la caracterización cinética y estructural de sus flavoproteínas o sistemas.

Palabras clave: flavoenzimas como biocatalizadores • mecanismos de flavoenzimas • métodos cinéticos rápidos • estructura y dinámica enzimática • biología química

METODOLOGÍAS UTILIZADAS EN NUESTRA INVESTIGACIÓN:

• Producción de proteínas nativas y mutantes mediante el uso de técnicas de ingeniería de proteínas.
• Expresión de proteínas homólogas y heterólogas en diferentes microorganismos.
• Purificación de proteínas (electroforesis, métodos cromatográficos, HPLC, FPLC…).
• Espectrometría de absorción: estudios cinéticos en estado estacionario, espectroscopia diferencial, afinidad de unión, determinación de potenciales de reducción de punto medio.
• Uso de técnicas de cinéticas transitorias como flujo detenido y fotólisis inducida por pulso de láser.
• Interacción y ensayos cinéticos en condiciones anaeróbicas.
• Espectroscopia de fluorescencia y dicroísmo circular.
• Cristalización de proteínas y difracción de rayos X para la determinación de estructuras 3D de proteínas y complejos proteicos.
• Técnicas avanzadas relacionadas con la resonancia paramagnética electrónica (ESEEM, HYSCORE, ENDOR).
• Calorimetrías de titulación isoterma y de barrido diferencial.
• Métodos de Biología Computacional: Docking, Dinámicas Moleculares y Simulaciones QM / MM.

PUBLICACIONES RELEVANTES

1.- The catalytic cycle of the antioxidant and cancer-associated human NQO1 enzyme: hydride transfer, conformational dynamics and functional cooperativity. Ernesto Anoz-Carbonell, David J. Timson, Angel Pey and Milagros Medina. Antioxidants 9, 972. DOI: 10.3390/antiox9090772 (2020)

2.- The apoptosis-inducing factor family: Moonlighting proteins in the crosstalk between mitochondria and nuclei. Nerea Novo, Patricia Ferreira, Milagros Medina M. IUBMB Life 2020,1–14. DOI: 10.1002/iub.2390 (2020)

3.- In silico discovery and biological validation of ligands of FAD synthase, a promising new antimicrobial target. Isaias Lans, Ernesto Anoz-Carbonell, Karen Palacio-Rodríguez, José Antonio Aínsa, Milagros Medina and Pilar Cossio. PLOS Computational Biology, 19. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1007898 (2020)

4.- Human riboflavin kinase: Species‐specific traits in the biosynthesis of the FMN cofactor. Ernesto Anoz‐Carbonell, Maribel Rivero, Victor Polo, Adrián Velázquez‐Campoy, Milagros Medina. The FASEB Journal, 34, 8. DOI: 10.1096/fj.202000566R (2020)

5.- Redox and ligand binding dependent conformational ensembles in the human apoptosis-inducing factor regulate its pro-life and cell death functions. Raquel Villanueva, Silvia Romero-Tamayo, Ruben Laplaza, Juan Martínez-Olivan, Adrián Velázquez-Campoy, Javier Sancho, Patricia Ferreira and Milagros Medina. Antioxidants and Redox Signaling. 20;30(18):2013-2029. DOI: 10.1089/ars.2018.7658. (2019)

6.- Towards the competent conformation for catalysis in the ferredoxin-NADP⁺ reductase from the Brucella ovis pathogen. Daniel Pérez-Amigot, Victor Taleb, Sergio Boneta, Ernesto Anoz-Carbonell, Maria Sebastián, Adrián Velázquez-Campoy, Victor Polo, Marta Martínez-Júlvez, and Milagros Medina. Biochim Biophys Acta Bioenerg, 1860:148058. DOI: 10.1016/j.bbabio.2019.148058. (2019)

7.- Self-sustained enzymatic cascade for the production of 2, 5-furandicarboxylic acid from 5-methoxymethylfurfural. Juan Carro, Elena Fernández-Fueyo, Carmen Fernández-Alonso, Javier Cañada, René Ullrich, Martin Hofrichter, Miguel Alcalde, Patricia Ferreira, Ángel T. Martínez. Biothechnology for Biofuels 11 – 1, pp. 86 (2018)

8.- Discovery of antimicrobial compounds targeting bacterial FAD synthetase. María Sebastián, Ernesto Anoz-Carbonel, Begoña Gracia, Pilar Cossio, José Antonio Aínsa, Isaías Lans and Milagros Medina. J. Enz. Inhib. Med. Chem. 33, 241-254 (2018)

9.- Identification of inhibitors targeting the Ferredoxin-NADP⁺ reductase from the Xanthomonas citri subsp citri phytopathogenic bacteria. Marta Martínez-Júlvez, Guillermina Goñi, Daniel Pérez- Amigot, Rubén Laplaza, Irina Ionescu, Silvana Petrocelli, María Laura Tondo, Javier Sancho, Elena Orellano and Milagros Medina. Molecules 23. E29. (2018)

10.- Multiple implications of an active site phenylalanine in the catalysis of aryl-alcohol oxidase. Juan Carro, Pep Amengual-Rigo, Ferran Sancho, Milagros Medina, Víctor Guallar, Patricia Ferreira, Ángel T. Martínez. Scientific Reports 8(1):8121 (2018)

11.- Proline dehydrogenase from Thermus thermophilus does not discriminate between FAD and FMN as cofactor. Mieke M.E.  Huijbers, Marta Martínez-Júlvez, Adrie H. Westphal, Estela Delgado-Arciniega, Milagros Medina and Willem J.H. van Berkel. Scientific Reports 7:43880 (2017)

12.- The trimer interface in the quaternary structure of the bifunctional prokaryotic FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes. Ana Serrano, María Sebastián, Sonia Arilla-Luna, Silvia Baquedano, Beatriz Herguedas, Adrián Velázquez-Campoy, Marta, Martínez-Júlvez and Milagros Medina. Scientific Reports 7:404 (2017)

13.- Protein dynamics promote hydride tunnelling in substrate oxidation by aryl- alcohol oxidase. Juan Carro, Marta Martínez-Júlvez, Milagros Medina, Angel T. Martínez and Patricia Ferreira. Phys.Chem.Chem.Phys. 19, 28666 (2017)     

14.- Redox proteins of hydroxylating bacterial dioxygenases establish a regulatory cascade that prevents gratuitous induction of tetralin biodegradation genes. Laura Ledesma-García, Ana Sánchez-Azqueta, Milagros Medina, Francisca Reyes-Ramírez and Eduardo Santero. Scientific Reports 6:23848 (2016)

15.- Key residues regulating the reductase activity of the human mitochondrial apoptosis inducing factor. Raquel Villanueva, Carlos Marcuello, Alejandro Usón, M. Dolores Miramar, Maria Luisa Peleato, Ana Lostao, Santos A. Susin, Patricia Ferreira, and Milagros Medina. Biochemistry 54, 5175-5184 (2015)

16.- Dynamics of the active site architecture in plant-type Ferredoxin-NADP⁺ reductases catalytic complexes. Ana Sánchez-Azqueta, Daniela L. Catalano-Dupuy, Arleth López-Rivero, María Laura Tondo, Elena G. Orellano, Eduardo A. Ceccarelli, and Milagros Medina. BBA-Bioenergetics 1837, 1730-1738 (2014)

17.- Structural insights into the coenzyme mediated monomer-dimer transition of the pro-apoptotic Apoptosis Inducing Factor. Patricia Ferreira, Raquel Villanueva, Marta Martínez-Júlvez, Beatriz Herguedas, Carlos Marcuello, Patricio Fernandez-Silva, Lauriane Cabon, Juan A. Hermoso, Anabel Lostao, Santos A. Susin and Milagros Medina. Biochemistry 53, 4204-4215 (2014)

18.- Theoretical study of the mechanism of the hydride transfer between Ferredoxin NADP⁺ reductase and NADP⁺. The role of Tyrosine 303. Isaías Lans, Milagros Medina, Edina Rosta, Gerhard Hummer, Mireia García-Viloca, José M. Lluch, and Àngels González-Lafont. J. Am. Chem. Soc. 134, 20544-20553 (2012)

PRINCIPALES PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

1.- Flavoenzymes in Health, Disease and Drug Discovery (FIHDADD). PID2019-103901GB-I00. Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities. June 2020-June 2023. University of Zaragoza. Research Leaders: Milagros Medina and Patricia Ferreira.

2.- Paramagnetic Species in Catalysis Research. A Unified Approach Towards Heterogeneous, Homogeneous and Enzyme Catalysis (PARACAT). 813209. Program Marie Sklodovswka Curie, EU. Innovative Training Networks (ITN). January 2019-December 2022. Universities of Zaragoza, Turín, Amberes, Cardiff y Leipzig. Research Leader: Inés García Rubio from UNIZAR.

3.- Structural Biology Reference Group. E35_20R. Diputación General de Aragón (DGA). January 2020-December 2022. University of Zaragoza. Research Leader: Milagros Medina.

4.- Flavoenzymes: molecular mechanisms and targets, pathologies and Biotechnological applications. BIO2016-75183-P. Spanish Ministry of Economy and Competitiviness (MINECO). January 2017-December 2019. University of Zaragoza. Research Leader: Milagros Medina.

5.- Flavoenzyme dependent systems: from action mechanisms to biotechnological and sanitary applications. BIO2013-42978-P. Spanish Ministry of Economy and Competitiviness (MINECO). January2014-December 2016. University of Zaragoza. Research Leader: Milagros Medina.

6.- Seguimiento de los cambios conformacionales del dominio apoptótico del Factor de Inducción de Apoptosis Humano (hAIF) con marcaje selectivo de espín y espectroscopia de EPR. University of Zaragoza. January 2015-December 2015. Research Leader: Patricia Ferreira.

7.- Retos enzimáticos, químicos y de ingeniería para la utilización de los recursos agroforestales no alimentarios (lignocelulosa) en una bio-economía más sostenible y menos contaminante. AC2015-00008-00-00. Spanish Ministry of Economy and Competitiviness (MINECO). July 2015-March 2017. CIB-CSIC/ University of Zaragoza and others. Research Leader: Susana Camarero Fernández.

8.- Structure-based drug design for diagnosis and treatment of neurological diseases: dissecting and modulating complex function in the monoaminergic systems of the brain. COST ACTION CM1103. EU. November 2011-November 2015. University of St. Andrews+18. Research Leader: Rona Ramsay.

9.- Catalytic mechanisms in flavoenzymes: keys for their biotechnological and therapeutic use. BIO2010-14983. Spanish Ministry of Science and Innovation. January 2011- September 2014. University of Zaragoza. Research Leader: Milagros Medina.

10.- Propiedades pro-apoptótica y oxido-reductasa de la proteína mitocondrial AIF (factor de inducción de apoptosis): ¿Funciones biológicas independientes o complementarias? Ref. 212363 (JIUZ-2012-BIO-01). University of Zaragoza. January 2013-December 2013. Research Leader: Patricia Ferreira.

PATENTS

Enzymatic Composition and Enzymatic process for the production of 2,5-furandicarboxylic acid from 5-methoxymethylfurfural using said enzymatic composition. J. Carro, E. Fernández-Fueyo, M. Alcalde, P. Ferreira, R. Ullrich, M. Hofrichter, AT. Martinez. CSIC, University of Zaragoza and Technical University of Dresden. 2017.

COLABORADORES

Del BIFI

Dr. Adrián Velázquez-Campoy
Dr. Pier Paolo Bruscolini
Dr. Ramón Hurtado-Guerrero
Dr. José Alberto Carrodeguas
Dr. José Antonio Aínsa
Dr. Patricio Fernández
Dr. Raquel Moreno
Dr. Víctor Polo
Dr. Javier Sancho

De otras instituciones

Instituto de Nanociencia de Aragón (INA), Zaragoza
– Dr. Ana Isabel Gracia Lostao
Estación Experimental de Aula Dei, Zaragoza
– Dr. Inmaculada Yruela
Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina
– Prof. Néstor Carrillo
– Dr. Eduardo Ceccarelli
– Dr. Elena Orellano
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid
– Dr. Ángel Martínez
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla-CSIC. Sevilla
– Dr. Manuel Hervás
– Dr. José A. Navarro
Centre de Recherche des Cordeliers, Paris, France 
– Dr. Santos Susín
Universita degli Studi di Bari
– Dr. Maria Barile
Universidad de Sao Paolo, Brasil
– Dr. M Cristina Nonato
Clark University, Biology Department, USA
– Dr. David Scott Hibbett
Universidad de Granada
– Dr. Angel L. Pey
Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón
– Dr. Pilar María Muñoz Álvaro
Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Salamanca  
– Dr. Mónica Balsera Diéguez
University of Antioquia UdeA, Medellin, Colombia.
– Dr. Pilar Cossio
Universitat Jaume I, Castellón
– Dr. Vicent Moliner

Malplegamiento y Agregación Amiloide de Proteínas

Responsable de la Línea de Investigación:

Dr. Nunilo Cremades

Investigadores:

José Daniel Camino, estudiante de doctorado
Pablo Gracia, estudiante de doctorado
Diego De la Fuente, estudiante de doctorado
David Polanco Irisarri, estudiante de doctorado

RESUMEN

El fenómeno de malplegamiento y agregación amiloide de proteínas ha emergido en los últimos años como un tema de relevancia fundamental en un amplio rango de disciplinas científicas como la física, química, biología y medicina. Esta explosión de interés ha surgido tras el reconocimiento de que aproximadamente 50 enfermedades y desordenes humanos están asociados con el proceso de malplegamiento y agregación amiloide de proteínas, algunos de los cuales se encuentran entre las condiciones médicas más comunes y debilitantes del mundo moderno, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, de Parkinson y la diabetes tipo II.

A pesar del impacto social y económico de algunas de estas enfermedades, se desconocen los orígenes moleculares y mecanismos de la agregación amiloide de proteínas, así como de su toxicidad asociada. La investigación desarrollada en el grupo liderado por la Dra. Nunilo Cremades aspira a resolver estas cuestiones fundamentales mediante la combinación de un amplio rango de técnicas biofísicas, incluyendo fluorescencia de partícula única, con experimentos de biología celular. Se pretende, además, identificar nuevas dianas proteicas para el desarrollo de herramientas de diagnóstico precoz y de tratamientos más efectivos para este tipo de enfermedades.

Figure 1. El desarrollo y la aplicación de técnicas de fluorescencia de partícula única nos ha permitido investigar el proceso de agregación amiloide con un nivel de detalle sin precedente e identificar nuevas posibles dianas terapéuticas. Cremades N. et al. Cell 2012.

Figure 2. Recientemente hemos sido capaces de purificar especies oligoméricas muy estables de alpha-synucleina, proteína cuya agregación y deposición está asociada al desarrollo de la enfermedad de Parkinson, y hemos mostrado que estas especies son altamente tóxicas y tienen propiedades generales comunes con otras especies oligoméricas generadas por otras proteínas amiloidogénicas. Mediante la combinación de un amplio rango de métodos biofísicos con técnicas de reconstrucción de imágenes de criomicroscopía electrónica hemos sido capaces de obtener modelos estructural tridimensionales y revelar la arquitectura estructural cuaternaria de estos oligoméros tóxicos de alpha-synucleina. Chen SW. et al. PNAS USA 2015.

Figura 3. Hemos estudiado el papel del agua en la modulación de la barrera energética para la nucleación amiloide de alfa-sinucleína y hemos descubierto que, en condiciones de baja actividad de agua, la nucleación homogénea de la proteína para la formación de agregados amiloides es órdenes de magnitud más rápida que en condiciones de hidratación alta. Hemos demostrado también que este tipo de nucleación es muy favorable en el interior de condensados biomoleculares, también llamados orgánulos sin membrana, formados por separación de fases líquido-líquido de la proteína. Camino et al. Chem. Sci. 2020.

Otras líneas de investigación:

El grupo también está interesado en la comprensión del papel del desorden estructural intrínseco de proteínas en su función, así como en el desarrollo de enfermedad.

Figure 4. Ejemplos de diagramas de fase típicos para una proteína nativamente plegada y una proteína intrínsicamente desordenada. Recientemente hemos caracterizado el paisaje conformacional y energético de una enzima natural intrínsicamente desordenada. Esta proteína adopta un amplio rango de conformaciones tipo glóbulo fundido, pre-glóbulo fundido y totalmente desplegada dependiendo de las condiciones en las que se encuentra. Zambelli and Cremades et al. Mol. Biosyst. 2012.

Figure 5. La presencia de un tipo específico de desorden estructural (conformaciones tipo glóbulo fundido) correlaciona con la habilidad de la proteínas lisozima humana de formar fibras amiloides (la mutación I56T en esta proteína es la responsable de una forma hereditaria de la enfermedad amiloidosis sistémica). Dhulesia and Cremades et al. J. Am. Chem. Soc. 2010

PUBLICACIONES RELEVANTES

1. The extent of protein hydration dictates the preference for heterogeneous or homogeneous nucleation generating either parallel or antiparallel b-sheet alpha-synuclein aggregates. Camino J.D., Gracia P., Chen S.W., Sot J., de la Arada I., Sebastián V., Arrondo J.L.R., Goñi F.M., Dobson C.M. and Cremades N. Chem. Sci. 2020, DOI: 10.1039/D0SC05297C

2. Defining alpha-synuclein species responsible for Parkinson´s disease phenotypes in mice. Froula J.M., Castellana-Cruz M., Anabtawi N.M., Camino J.D., Chen S.W., Thrasher D.R., Freire J., Yazdi AA., Fleming S., Dobson C.M., Kumita J.R., Cremades N. (co-corresponding author) and Volpicelli-Daley L.A. J. Biol. Chem. 2019, 294(27):10392-10406. Selected paper of the year in JBC in the area “Molecular basis of disease”.

3. The contribution of biophysical and structural studies of protein self-assembly to the design of therapeutic strategies for amyloid diseases. Cremades N. and Dobson C.M. Neurobiol. Dis. 2018, 109:178-190

4. Structural basis of membrane disruption and cellular toxicity by alpha-synuclein oligomers. Fusco G., Chen S.W., Williamson P.T.F., Cascella R., Perni M., Jarvis J.A., Cecchi C., Vendruscolo M., Chiti F., Cremades N., Ying L., Dobson C.M. and De Simone A. Science 2017, 358(6369): 1440-1443.

5.  Inhibition of alpha-synuclein fibril elongation by Hsp70 is governed by a kinetic binding competition between alpha-synuclein species. Aprile F.A., Arosio P., Fusco G., Chen S.W., Kumita J.R., Dhulesia A., Tortora P., Knowles T.P., Vendruscolo M., Dobson C.M. and Cremades N. Biochemistry 2017, 56(9): 1177-1180.

6. Amyloid-b and a-synuclein decreases the level of metal-catalyzed reactive oxygen species by radical scavenging and redox silencing. Pedersen J.T., Chen S.W., Borg C.B., Ness S., Bahl J.M., Heegaard N.H., Dobson C.M., Hemmingsen L., Cremades N. (co-corresponding author) and Teilum K. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138(12):3966-9.

7. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson’s disease. Deas E., Cremades N., Angelova P.R., Ludtmann M.H., Yao Z., Chen S.W., Horrocks M.H., Banushi B., Little D., Devine M.J., Gissen P., Klenerman D., Dobson C.M., Wood N.W., Gandhi S. & Abramov AY. Antioxid. Redox Signal. 2016, 24(7):376-91.

8. Structural characterization of toxic oligomers that are kinetically trapped during α-synuclein fibril formation. Chen S.W., Drakulic S., Deas E., Ouberai M., Aprile F.A., Arranz R., Ness S., Roodveldt C., Guilliams T., De-Genst E.J., Klenerman D., Wood N.W., Knowles T.P.J., Alfonso C., Rivas G., Abramov A.Y., Valpuesta J.M., Dobson C.M. and Cremades N. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 2015, 112(16):E1994-2003.

9. Direct observation of the interconversion of normal and toxic forms of alpha-synuclein. Cremades N., Cohen S.I., Deas E., Abramov A.Y., Chen A.Y., Orte A., Sandal M., Clarke R.W., Dunne P., Aprile F.A., Bertoncini C.W., Wood N.W., Knowles T.P.J., Dobson C.M. & Klenerman D. Cell 2012, 149(5): 1048-59.

PRINCIPALES PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

Proyectos vigentes en la actualidad

• PGC2018-096335-B-100: “Understanding Parkinson´s disease alpha-synuclein amyloid formation in the cell: From single-molecule biophysics in cell-like test tubes to organs-on-chips”. Sponsor: Ministerio Español de Ciencia, Innovación y Universidades, Agencia Estatal de Investigación / EU (Fondos FEDER). IP: Dra. Nunilo Cremades y Dr. José A. Carrodeguas.1/01/2019 – 31/12/2022
• UZCUD2020-BIO-01: “Caracterización de las primeras interacciones entre moléculas de alfa-sinucleína que llevan a la formación de agregados tóxicos involucrados en la enfermedad de Párkinson”. Sponsor: Universidad de Zaragoza. IP: Dra. Nunilo Cremades y Dra. Inés García. 1/10/2020 – 30/09/2021.

Colaboradores

Laura Volpicelli-Daley (University of Alabama, USA)
Fabrizio Chiti (University of Florence, Italy)
Janet Kumita (University of Cambridge, UK)
Douglas V. Laurents (IQFR-CSIC, Spain)
Felix Goñi (Basque Centre for Biophysics, Spain)
Arturo Muga (Basque Centre for Biophysics, Spain)
Paola Picotti (ETH Zurich, Switzerland)

Contacto

Dra. Nunilo Cremades

Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos
Universidad de Zaragoza
Mariano Esquillor S/N. Edificio I+D+i
Zaragoza 50018, Spain
Teléfono: +34-876555417
Email:  ncc@unizar.es

Diagnóstico Clínico y Drug Delivery

Responsable de la Línea de Investigación:

Olga Abian Franco

Investigadores:

Rafael Clavería, Predoctoral Student
María Arruebo, Predoctoral Student
Alberto Rodrigo, Predoctoral Student
Arturo Vinuesa, Predoctoral Student

RESUMEN

Diagnóstico clínico

La Calorimetría diferencial de barrido (DSC) ha surgido recientemente como una técnica prometedora que proporciona información útil sobre interactómica de suero / plasma (composición en proteínas y metabolitos, así como sus interacciones).

Como resultado de la enfermedad, la composición de suero / plasma se altera y es posible discriminar entre individuos sanos y los pacientes con ciertas enfermedades.

Un estudio previo realizado en nuestro grupo (25 sujetos sanos y 60 pacientes con adenocarcinoma gástrico) mostró que había diferencias significativas en las variables obtenidas a partir de los perfiles calorimétricos de pacientes con adenocarcinoma gástrico y sanos y también entre pacientes con diferentes estadios de la enfermedad.

En esta línea de investigación se propone la validación y la aplicación de una metodología (DIGCAL) como una herramienta útil en el diagnóstico y seguimiento de patologías tumorales (adenocarcinoma ductal pancreático, lesiones quísticas pancreáticas preneoplásicas y cáncer de estómago), así como en el aislamiento y la identificación de biomarcadores potenciales tumorales.

Los perfiles calorimétricos de suero de sujetos sanos y pacientes con los tres tipos de cáncer en diferentes etapas se obtendrán antes y después de 6 meses de tratamiento clínico. El análisis multiparamétrico de los perfiles térmicos nos permitirá establecer un protocolo clínico para: 1 / cribado de un determinado proceso tumoral; 2 / pacientes que clasifican de acuerdo a su estadio tumoral; 3 / control de la progresión o el control de la enfermedad; 4 / identificación de biomarcadores específicos para cada tipo de enfermedad.

DIGCAL podría llegar el nivel clínico no sólo como una herramienta de diagnóstica, sino también como un sistema de monitorización y seguimiento de los pacientes durante el tratamiento terapéutico, la adición de valor en las decisiones de pronóstico o farmacológicos. Al mismo tiempo, los biomarcadores potenciales identificados podrían ser parte de un kit de diagnóstico fácil de usar para los puntos de atención primaria.

Drug Delivery

Drug delivery es el método o proceso de administración de un compuesto farmacológico para alcanzar un efecto terapéutico en humanos o animales. Las tecnologías de drug delivery modifican el perfil de liberación del fármaco (absorción, distribución, y eliminación) en beneficio de la mejora de su eficacia y seguridad, además de evitar inconvenientes a los pacientes y hacer más cómodo su utilización. La liberación de las drogas puede basarse en difusión, degradación, y mecanismos de afinidad. Las rutas de administración más comunes incluyen preferentemente las vías no invasivas como peroral (a través de la boca), tópica (piel), transmucosal (nasal, bucal/sublingual, vaginal, ocular y rectal) y rutas de inhalación.

Muchos medicamentos como péptidos, proteínas, anticuerpos, vacunas y drogas basadas en genes, generalmente no pueden ser utilizados utilizando estas rutas ya que pueden ser susceptibles de degradación enzimática o puede que no sean incorporadas al sistema circulatorio a una concentración terapéuticamente efectiva debido a su tamaño molecular y carga. Por esta razón muchos fármacos basados en proteínas y péptidos han de ser distribuidos mediante inyección (por ejemplo, muchas inmunizaciones en las que han de liberarse proteínas).

Los esfuerzos actuales en el área de drug delivery incluyen el desarrollo de liberación dirigida en el que el fármaco sólo es activo en una zona concreta del cuerpo (por ejemplo, tejido cancerígeno) y las formulaciones son de liberación sostenida en las que el fármaco se libera durante un cierto periodo de tiempo de manera controlada. Para alcanzar una eficiente liberación dirigida, el sistema diseñado debe evitar los mecanismos de sistema de defensa del paciente y llegar a su pretendido sitio de acción. Tipos de formulaciones de liberación sostenida incluyen liposomas, microesferas cargadas biodegradables y polímeros conjugados con fármacos. En este sentido, las nanopartículas (NP) en biomedicina representan una tecnología prometedora para el transporte y liberación de fármacos. Hay muchas posibilidades de funcionalización de la superficie de las NP y gracias a esta versatilidad, se pueden desarrollar diferentes estrategias para incluir fármacos en ellas (permitiendo a las NP ir mayoritariamente al lugar de acción).

Esta línea de investigación representa una nueva estrategia para la inclusión de algunos compuestos antivirales activos contra el virus de la hepatitis C (VHC), que se desarrollaron previamente en este grupo.

Se han utilizado varios materiales:

1/ Ciclodextrinas:

La estructura química de las CD, oligosacáridos cíclicos compuestos de residuos alfa-1,4-glucosídicos, les confieren propiedades estructurales y propiedades físico-químicas óptimas que permiten su uso como portadores moleculares.

En su cavidad hidrofóbica pueden ser atrapados una amplia gama de compuestos que van desde los iones a las proteínas. Además, presentan baja citotoxicidad e inmunogenicidad.
Los complejos CD-droga se han utilizado en el campo farmacéutico con el fin de mejorar las propiedades de absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad (ADMET) relacionados con la PI de un fármaco (por ejemplo, solubilidad, la estabilidad, la entrega y la liberación, la permeabilidad de la membrana y la absorción, la toxicidad). En la actualidad, más de 30 productos que se pueden encontrar en el mercado basados en complejos de CD.

2/ Shell Cross-Linked Polymeric Micelles

Las micelas poliméricas reticuladas (CLPM), formadas por copolímeros de bloques anfifílicos, han tenido éxito para aplicaciones biomédicas. Primero, puedan cumplir con esos requisitos generales para los sistemas de administración de fármacos: solubilidad en agua, de baja toxicidad, para aumentar la estabilidad del fármaco dentro de los organismos vivos, para facilitar la captación celular en comparación con el fármaco libre, y para producir su liberación controlada en un lugar específico. En segundo lugar, la naturaleza anfifílica de los resultados de polímeros constituyentes en un núcleo hidrófobo y una cubierta hidrófila que permite la encapsulación de los dos tipos de drogas. En tercer lugar, estas nanopartículas ofrecen aún más la estabilidad en condiciones de alta dilución, debajo de la concentración micelar crítica, en comparación con otras micelas poliméricas.

En efecto, la reticulación evita su desintegración en el torrente sanguíneo y la liberación de la droga antes de llegar a la célula diana. En particular, la fijación de la estructura de micelas por reticulación covalente inducida por la luz, sobre todo el empleo de grupos reactivos de acrilato, representa un procedimiento limpio y eficaz para preparar micelas poliméricas estables que pueden contener cualquiera de las moléculas solubles en agua y no solubles en agua y el transporte a través de el torrente sanguíneo.

3/ Block Copolymers Micelles

Los vehículizadores de fármacos poliméricos son uno de los retos actuales de la nanomedicina. Desde que se introdujo el concepto de encapsulación de fármacos física dentro de los agregados poliméricos, se han identificado un número significativo de ellos. En particular, la construcción de vehículos de fármacos basados en copolímero de bloques anfifílicos es un tema de gran interés y estimulante desde el punto de vista de la investigación interdisciplinaria en química, biología y ciencia de los materiales. En medio acuoso, el autoensamblaje de copolímeros en bloque anfifílicos (BCS) sirve para minimizar las interacciones hidrófobas energéticamente desfavorables en agua y pueden conducir a una gran variedad de nanoestructuras poliméricas incluyendo especialmente micelas esféricas y vesículas atractivas.

PUBLICACIONES RELEVANTES

1.- Polymeric micelles from block copolymers containing 2,6-diacylaminopyridine units for encapsulation of hydrophobic drugs.
Concellón A, Clavería-Gimeno E, Velázquez-Campoy A, Abian O, Piñol M, Oriol L.RSC Advances, 2016, 6, 24066–24075.

2.- Biophysical Screening for Identifying Pharmacological Chaperones and Inhibitors against Conformational and Infectious Diseases. Velazquez-Campoy A, Sancho J, Abian O, Vega S. Curr Drug Targets. 2016 Jan 31. [Epub ahead of print]

3.- Cysteine Mutational Studies Provide Insight into a Thiol-Based Redox Switch Mechanism of Metal and DNA Binding in FurA from Anabaena sp. PCC 7120. Botello-Morte L, Pellicer S, Sein-Echaluce VC, Contreras LM, Neira JL, Abian O, Velázquez-Campoy A, Peleato ML, Fillat MF, Bes MT. Antioxid Redox Signal. 2016, 24, 173-185.

4.- On the link between conformational changes, ligand binding and heat capacity. Vega S, Abian O, Velazquez-Campoy A. Biochim Biophys Acta. 2015 Oct 14. pii: S0304-4165(15)00274-3.

5.- Shell Cross-Linked Polymeric Micelles as Camptothecin Nanocarriers for anti-HCV Therapy. Jiménez-Pardo I, González-Pastor R, Lancelot A, Claveria-Gimeno R, Velázquez-Campoy A, Abian O, Ros MB, and Sierra T. Macromol. Biosci. 2015, 15, 1381–1391.

6.- Su1990 A New Technology for the Classification of Patients With Gastric Adenocarcinoma Based on Differential Scanning Calorimetry Serum Thermograms. Vega S, Garcia-Gonzalez MA, Lanas A, Velazquez-Campoy A, Abian O.*. Gastroenterology 148(4): S-569 · April 2015

7.- Rescuing compound bioactivity in a secondary cell-based screening by using γ-cyclodextrin as a molecular carrier. Clavería-Gimeno R, Vega S, Grazu V, De la Fuente JM, Lanas A, Velazquez-Campoy A, Abian O.*. International Journal of Nanomedicine 2015, 10: 2249-2259.

8.- Deconvolution Analysis for Classifying Gastric Adenocarcinoma Patients Based on Differential Scanning Calorimetry Serum Thermograms. Vega S, Garcia-Gonzalez MA, Lanas A, Velazquez-Campoy A, Abian O.*. Scientific reports, 5:7988 (2015).

9.- Ionic liquids in water: a green and simple approach to improve activity and selectivity of lipases.
Filice M, Romero O,  Abian O, De las Rivas B and Palomo J.M. RSC Advances 4: 49115- 49122 (2014).

10.- A unified framework based on the binding polynomial for characterizing biological systems by isothermal titration calorimetry. Vega S., Abian O.*and Velazquez-Campoy A. Methods. 2014 pp: S1046-2023(14) 00316-8.

11.- Allosteric Inhibitors of the NS3 Protease From the Hepatitis C Virus. Abian O.*, Vega S., Sancho J., Velazquez-Campoy A. PLOSone 2013, 8 (7): 69773.

12.- NS3 protease from hepatitis C virus: Biophysical studies on an intrinsically disordered protein domain. Vega S., Neira J.L., Marcuello C.,  Lostao A., Abian O. * and Velazquez-Campoy A. International Journal of Molecular Sciences 2013, 14: 13282-13306.

13.- Experimental Validation of In Silico Target Predictions on Synergistic Protein Targets. Cortes-Ciriano I, Koutsoukas A, Abian O, Velazquez-Campoy A and Bender A. MedChemComm 2013, 4, 278–288.

14.- Altering the interfacial activation mechanism of a lipase by solid-phase selective chemical modification. López-Gallego F, Abian O, Guisán JM. Biochemistry. 2012 Sep 4;51(35):7028-36.

15.- Semisynthetic peptide-lipase conjugates for improved biotransformations. Romero O, Filice M, de las Rivas B, Carrasco-Lopez C, Klett J, Morreale A, Hermoso JA, Guisan JM, Abian O, Palomo JM. Chem Commun (Camb). 2012 Sep 18;48(72):9053-5.

PRINCIPALES PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

Proyectos Actuales:

1.- Analysis of protein/metabolites interactions in plasma serum using calorimetry: application as a quick and noninvasive diagnostic method for early detection and monitoring of tumoral digestive diseases (DIGCAL). Funding Institution: Health Institute Carlos III. From: January 2016 To: December 2018. Principal Investigator (PI): Olga Abian Franco.

2.- Validación de un nuevo método diagnóstico en suero, rápido no invasivo para detección precoz de cáncer de páncreas (PANCal). Funding Institution: Asociación Española de Gastroenterología (AEG). From: 2015 To: 2016. Principal Investigator (PI): Olga Abian Franco.

Proyectos Anteriores:

3.- Adapted Nanoparticles for transport and specific release of drugs against hepatitis C virus (VHC).
Funding Institution: Health Institute Carlos III. From: 2011 To: 2013. Principal Investigator (PI): Olga Abian Franco.

4.- Implementation of in vitro e in vivo studies of anti-infectious compounds effective against Helicobacter pylori y el HCV (hepatitis C virus). Funding Institution: Health Institute Carlos III. From: 2008 To: 2011. Principal Investigator (PI): Olga Abian Franco.

Colaboradores

Colaboradores del BIFI

Dr. Adrián Velázquez-Campoy
Prof. Javier Sancho
Dr. Jose Luis Neira

Colaboradores de otras Instituciones

James Graham Brown Cancer Center, University of Louisville, Louisville, KY, EEUU
PhD. Nichola Garbett

Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (I+CS), Zaragoza
Prof. Angel Lanas
Dra. Trinidad Serrano
Dra. Estela Solanas

Instituto de Ciencia de Materiales de Aragón (ICMA). Química Orgánica. Facultad de Ciencias.
Dra. Teresa Sierra
Prof. Luis Oriol
Prof. Milagros Piñol

Instituto de Nanociencia (INA), Universidad de Zaragoza, Zaragoza
Dr. Jesús Martínez de Lafuente
Dra. Valeria Grazú
Dra. Berta Saez

Universidad de San Jorge (USJ)
Prof. Victor López
Prof. Elisa Langa

Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid.
Dr. Jose Miguel Palomo
Dr. Fernando López Gallego
Dr. Jose Manuel Guisan

Universidad de Zaragoza
Dr. Jose Antonio Ainsa

Unidad de Investigación Traslacional, Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza
Dra. Pilar Alfonso
Dra. Pilar Giraldo
Dr. Miguel Pocovi

Servicio de Microbiología-INIBIC. Complejo Hospitalario Universitario A Coruña, La Coruña
Dr. Francisco José Pérez-Llarena

Transducción de señales y terapias en proteínas de membrana

Responsable de la Línea de Investigación:

Javier García Nafría

Página del grupo personal:
https://sites.google.com/view/signal-transduction-lab/homepage

Investigadores:

Sandra Arroyo Urea, PhD student
Ángela Carrión Antolí, PhD stuednt
Iris del Val García, PhD student
Natalia Garré Ramo Researcher
Andrés Manuel González Ramirez, Postdoctoral Researcher
Kleopatra Papadouli, Erasmus+ Researcher

RESUMEN

Complejos proteicos de la membrana cerebral

Las proteínas de membrana representan el 30% del genoma humano, son responsables de la comunicación intercelular y tienen una gran relevancia médica, con el 60% de los fármacos usando una proteína de membrana como diana. Las proteínas de membrana juegan un papel especialmente importante en el cerebro, donde la comunicación intercelular es la base de su función y da lugar a la formación de memoria y la consciencia. El objetivo del grupo es entender como los receptores neuronales funcionan, diseccionando como detectan estímulos externos y los transducen al interior celular. Tenemos especial interés en entender la integración de señales a través de complejos de receptores, que vuelven muy compleja la interpretación de señales, pero además son una nueva ruta para desarrolar fármacos mas específicos. Para llevar a cabo la investigación usamos un enfoque integrado de biología estructural (crio-microscopía electrónica y cristalografía de rayos X), biofísica y ensayos bioquímicos. La crio-microscopía electrónica de alta resolución juega un papel importante es nuestros estudios ya que podemos determinar estructuras de proteínas de membrana que antes eran inviables por cristalografía de rayos X.

Herramientas de ingeniería de proteínas

Las proteínas de membrana son intrínsecamente inestables fuera del entorno de la membrana. Para solucionar este problema desarrollamos nuestras herramientas de ingeniería de proteínas que tienen como fín estabilizar el plegamiento y maximizar la expresión de proteínas. Recientemente hemos desarrollado un sistema de clonaje que simplifica todos los protocolos de modificación de genes en plásmidos (García-Nafría, Sci. Rep, 2016 and Watson, JBC, 2019). Esto permite crear, de manera simple y rápida, crear librerías de cDNA de proteínas que se usan a posteriori para encontrar modificaciones estabilizantes. Este sistema se puede usar en cualquier laboratorio biomédico y con cualquier tipo de proteína expresada.

Metodologías utilizadas

• Clonación de genes y técnicas de DNA recombinante.
• Ingeniería de proteínas.
• Producción de proteínas en bacteria, células de insecto y células de mamífero.
• Purificación de proteínas.
• Resonancia de plasmón superficial (Biacore).
• Microscale thermophoresis.
• Cristalografía y difracción de rayos X de macromoléculas.
• Crio-microscopía electrónica de partícula única de alta resolución.
• Ensayos bioquímicos y funcionales en células.

Relevant publications

1. Structural insights into promiscuous GPCR-G protein coupling.Carrión-Antolí A., Mallor-Franco J., Arroyo-Urea S., García-Nafría J.Progress in Molecular Biology and Translational Science. 2022. In press.

2. Structure determination of GPCRs: cryo-EM compared with X-ray crystallography. García-Nafría J, Tate CG. Biochem Soc Trans. 2021 Sep 28:BST20210431. doi: 10.1042/BST20210431.

3. Molecular determinants of β-arrestin coupling to formoterol-bound β1-adrenoceptor. Lee Y., Warne T., Nehme R., Pandey S., Chaturvedi M., Dwivedi-Agnihotri H., Edwards P., García-Nafría J., Leslie A., Shukla AK., Tate CG. Nature. 2020 Jun 17. doi: 10.1038/s41586-020-2419-1.

4. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: a re-emerging tool to simplify molecular cloning. Jake F. Watson and García-Nafría J. Journal of Biological Chemistry. 2019 Oct 18;294(42):15271-15281.

5.Cryo-Electron Microscopy: Moving Beyond X-ray Crystal Structures for Drug receptors and Drug development.García-Nafría J.* and Tate CG*.  Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology. 2020. In press. (*corresponding author)

6. Architecture of the heteromeric GluA1/2 AMPA receptor in complex with the auxiliary subunit TARP γ8. Herguedas B, Watson JF, Ho H, Cais O, García-Nafría J, Greger IH. Science. 2019 Mar 14. pii: eaav9011

7. Cryo-EM structure of the serotonin 5-HT1B receptor coupled to heterotrimeric Go. García-Nafría J., Nehme R., Edwards P., Tate CG. Nature. 2018, 558 (7711). 620-62.

8. Cryo-EM structure of the adenosine A_2A receptor coupled to an engineered heterotrimeric G protein.García-Nafría J., Lee Y., Bai X., Carpenter B. & Tate CG. Elife. 2018, May 4;7. pii: e35946.

9. Structure and organization of heteromeric AMPA-type glutamate receptors. Herguedas B*, García-Nafria J*, Cais O, Fernandez-Leiro R, Ho H, Krieger J, Greger IH. Science. 2016, Apr 29;352(6285):aad3873.

10. IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial In Vivo Assembly. García-Nafria J*, Watson JF, Greger IH. Scientific Reports.  2016, Jun 6;6:27459. (*corresponding author).

Main research projects

1.- Ministerio de Ciencia, Innovacion y Universidades. 163.350 euros.
PID2020-113359GA-I00. 2021-2024.

Collaborators

Ramón Hurtado Guerrero (BIFI, Zaragoza, Spain).
Jake Watson (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK).
Maria José Sanchez Barrena (CSIC, Madrid, Spain).
Beatriz Herguedas Francés (BIFI, Zaragoza, Spain).
Nunilo Cremades Casasín (BIFI, Zaragoza, Spain)..

Biología estructural de receptores de membrana neuronales

Responsable de la Línea de Investigación:

Beatriz Herguedas Francés

Investigadores:

Beatriz Herguedas Francés (IP)
Carlos Vega Gutiérrez (PhD student)
Irene Sánchez Valls (PhD student)

RESUMEN

Los receptores de glutamato tipo AMPA (AMPAR) son canales iónicos regulados que median la neurotransmisión rápida excitatoria en el sistema nervioso central y están involucrados en la plasticidad neuronal. Su disfunción se asocia con varias enfermedades, como la esclerosis lateral amiotrófica, la epilepsia y el infarto cerebral. Los receptores AMPAR son un grupo diverso de complejos proteicos con diferentes propiedades cinéticas, de tráfico celular y farmacológica. Esta diversidad se alcanza a diferentes niveles. Por un lado, el receptor tetramérico contiene un núcleo compuesto por 4 subunidades, (GluA1-4) que se ensamblan con diferentes estequiometrías (Herguedas et al 2013). Esta composición varía en diferentes regiones cerebrales y etapas del desarrollo (Schwenk et al 2014). El splicing alternativo y la edición de RNA aumentan todavía más la diversidad estructural y funcional de las subunidades GluA (Traynellis et al 2010). Finalmente, esta heterogenidad estructural se expande gracias a la interacción con más de 30 proteínas que interaccionan tanto de manera estable como transitoria con el núcleo tetramérico de GluA. El objetivo de nuestra línea de investigación es indagar en la diversidad estructural de los diferentes complejos AMPARs, utilizando la crío-microscopía electrónica, con el fin de determinar los mecanismos de acción de los receptores. Además, estamos interesados en explorar el efecto de lípidos y pequeñas moléculas el mecanismo de acción del receptor así como en aplicar técnicas de molécula única para explorar su dinámica.

El grupo liderado por Beatriz Herguedas forma parte del grupo DGA Neuromol, junto a los IPs Jose A. Carrodeguas, Nunilo Cremades y Javier García Nafría. Este grupo tiene como objetivo caracterizar proteínas neuronales -receptores, canales iónicos y proteínas intrínsecamente desordenadas- implicadas en neuropatologías. Además, somos parte grupo de Acción BioF-DTE (Implementación y desarrollo de herramientas BIOFísicas en el estudio, Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades)” del campus Iberus, un grupo de acción interuniversitario y transfronterizo con participación de las Universidades de Zaragoza, Lleida, La Rioja, Navarra y Toulouse (CNRs).

PUBLICACIONES RELEVANTES

1. Architecture of the heteromeric GluA1/2 AMPA receptor in complex with the auxiliary subunit TARP y8. Herguedas B*; Watson JF, Ho H; Cais O; García-Nafría J; Greger H*. Science, 2019 (*corresponding author)
2. Druggability simulations of ionotropic glutamate receptors reveal a high-susceptibility binding site in the GluA3 AMPA receptor N-terminal domain. Lee* JY, Krieger J. *, Herguedas B. *, García-Nafría J. *, Dutta A., Shaikh S., Greger I.H., and Bahar I.. Structure, 2018. (*co-first author)
3. Structure and organization of heteromeric AMPA-type glutamate receptors Herguedas B*, García-Nafría J*, Cais O, Fernández-Leiro R, Krieger J, Ho H, Greger IH.. Science. 2016. (*co-first author)
4. The dynamic AMPA receptor extracellular region: a platform for synaptic protein interactionS. García-Nafría J, Herguedas B, Watson JF, Greger IH. s. J Physiol. Review. 2016.
5. Structural insights into the synthesis of FMN in prokaryotic organisms. Herguedas B, Lans I, Sebastián M, Hermoso JA, Martínez-Júlvez M, Medina M. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2015.
6. Mapping the interaction sites between AMPA receptors and TARPs reveals a role for the receptor N-terminal domain in channel gating. Cais O, Herguedas B, Krol K, Cull-Candy SG, Farrant M, Greger IH. Cell Reports, 2014.
7. A hydrogen bond network in the active site of Anabaena ferredoxin-NADP(+) reductase modulates its catalytic efficiency. Sánchez-Azqueta A, Herguedas B, Hurtado-Guerrero R, Hervás M, Navarro JA, Martínez-Júlvez M, Medina M. BBA bioenergetics. 2014.
8. Receptor heteromeric assembly-how it works and why it matters: the case of ionotropic glutamate receptors. Herguedas B, Krieger J, Greger IH. Prog Mol Biol Transl Sci. Review. 2013.
9. Oligomeric state in the crystal structure of modular FAD synthetase provides insights into its sequential catalysis in prokaryotes Herguedas B, Martínez-Júlvez M, Frago S, Medina M and Hermoso JA.. J Mol Biol 2010.
10. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of FAD synthetase from Corynebacterium ammoniagenes. Herguedas B, Martínez-Júlvez M, Frago S, Medina M and Hermoso JA. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2009.
11. Flavodoxin: a compromise between efficiency and versatility in the electron transfer from Photosystem I to Ferredoxin-NADP(+) reductase. Goñi G, Herguedas B, Hervás M, Peregrina JR, De la Rosa MA, Gómez-Moreno C, Navarro JA, Hermoso JA, Martínez-Júlvez M, Medina M. BBA Bioenergetics. 2009.
12. Protein motifs involved in coenzyme interaction and enzymatic efficiency in anabaena ferredoxin-NADP+ reductase. Peregrina JR*, Herguedas B*, Hermoso JA, Martínez-Júlvez M, Medina M Biochemistry. 2009. (*co-first author)

PRINCIPALES PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

1. Structure and Dynamics of Calcium Permeable AMPA receptors. Agencia Estatal de Investigación. PID2019-106284GA-I00. (01/06/2020-31/05/2023). Principal Investigator.
2. Dotación Adicional Programa Ramón y Cajal. Agencia Estatal de Investigación. RYC2018-025720-I. 01/05/2020-30/06/2025. Principal Investigator.
3. AMPA Glutamate Receptors: the role of the extracellular domains in receptor assembly and allosteric regulation MRC Centenary Early Career Award. P.I. Beatriz Herguedas. 01/08/2012-30/09/2013. Principal Investigator.

Colaboradores

Ingo Greger (MRC Laboratory of Molecular Biology)
Javier García Nafría (Zaragoza)

CONTACTO: bherguedas@unizar.es

Modulación Enzimática & Mecanismos de Reacción

Responsable de la Línea de Investigación:

Pedro Merino Filella

Investigadores:

Manuel Pedrón (contratado pre-doctoral Gobierno de Aragón)
Sara Orta (contratado pre-doctoral Gobierno de Aragón)
Sandra Pereira (contratado pre-doctoral FPI)
Ignacio Sanz (contratado pre-doctoral FPI)

Colaboradores:

Tomas Tejero Lopez (ISQCH)
Iñaki Delso (ISQCH)

RESUMEN

SUBLINEA 1: Modulación y mecanismos de reacción enzimáticos

Nuestro grupo centra su actividad en conseguir comprender los procesos biológicos relacionados con la salud. El grupo posee una dilatada experiencia en síntesis orgánica asimétrica y cuenta con laboratorios bien equipados en la Facultad de Ciencias. Dentro del campo de la Química Biológica el grupo está interesado en el diseño y síntesis de pequeñas moléculas -principalmente compuestos nitrogenados y glicomiméticos- capaces de actuar como moduladores y/o inhibidores de enzimas diana asociados con procesos biológicos específicos. Entre otros enzimas, glicosiltransferasas y transglicosilasas son los principales objetivos. El desarrollo de estas actividades se lleva a cabo combinando una serie de técnicas multidisciplinares que incluyen metodologías sintéticas desarrolladas en nuestros laboratorios utilizando métodos de catálisis asimétrica orgánica y metálica, técnicas de biocomputación (docking y dinámica molecular) y técnicas espectroscópicas avanzadas como STD-NMR.

Figura 1. Glicosiltransferasa GalNAc-T2: Estudio de dinámica molecular e interacciones con un ligando diseñado en el grupo de investigación.

Figura 2. Glicosiltransferasa POFUT1: Mecanismo catalítico de tipo SN1 con formación de un par iónico en el estado de transición

SUBLINEA 2: Mecanismos de reacciones orgánicas.

El grupo está también interesado en estudiar mecanismos de reacción utilizando mecánica cuántica y aproximaciones topológicas modernas como análisis ELF (función de localización electrónica) y NCI (interacciones no covalentes)

Figura 3. Estudios QM y topológicos de mecanismos de reacción

Los estudios incluyen la elucidación de reacciones catalíticas, tanto catalizadas por metales como organocatalítcas. En particular, el grupo se dedica a estudiar el rol de ácidos fosfóricos quirales en reacciones organocatalíticas en las que se forman carbocationes transientes.

PUBLICACIONES RELEVANTES

1. Computational evidence of Glycosy Cations. Merino, P.; Delso, I.; Pereira, S.; Pedron, M.; Orta, S.; Tejero, T. Org. Biomol. Chem. 2021. doi:  10.1039/D0OB02373F
2. Enantio- and Diastereoselective Nucleophilic Addition of N-tert-Butyl Hydrazones to Isoquinolinium Ions through Anion-Binding Catalysis. Matador, E.; Iglesias-Sigüenza, J.; Monge, D.; Merino, P.; Fernández, R.; Lassaletta, J. M. Angew. Chem. Int. Ed. 2021,133, 5096-5101. doi:  10.1002/anie.202012861
3. Anomeric beta-triflate characterization enables the monitorization of glycosylation dynamics and suggests a non-canonical reinterpretation of the mechanism. Santana, A. G.; Montalvillo-Jiménez, L.; Díaz-Casado, L.; Corzana, F.; Jiménez-Osés, G.; Merino, P.; Cañada, F. J.; Jiménez-Barbero, J.; Gómez, A. M.; Asensio, J. L. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 12501-12514. doi:  10.1021/jacs.0c05525
4. Enantioselective Synthesis of Tropanes through Brønsted Acid-Catalyzed Pseudotransannular Desymmetrization. Rodriguez, S.; Uria, U.; Reyes, E.; Carrillo, L.; Tejero, T.; Merino, P.; Vicario, J. L. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 132, 6846-6850. doi:  10.1002/anie.202000650
5. Dissecting the Structural and Chemical Determinants of the “Open-to-Closed” Motion in the Mannosyltransferase PimA from Mycobacteria. Unzueta, A. R.; Ghirardello, M.; Urresti, S.; Delso, I.; Giganti, D.; Anso-Miqueleiz, I.; Trastoy, B.; Comino, N.; Tersa, M.; D’Angelo, C.; Cifuente, J. O.; Marina, A.; Durana, A.; Chenal, A.; Svergun, D. I.; Alzari, P. M.; Albesa-Jové, D.; Merino, P.; Guerin, M. E. Biochemistry 2020, 59, 2934-2945. doi:  10.1021/acs.biochem.0c00376
6. Enantioselective Synthesis, DFT Calculations and Preliminary Antineoplastic Activity of Dibenzo 1-Azaspiro[4.5]decanes on Drug Resistant Leukemias. Mendes, J. A.; Merino, P.; Soler, T.; Salustiano, E. J.; Costa, P. R. R.; Yus, M.; Foubelo, F.; Buarque, C. D. J. Org. Chem. 2019, 84, 2219-2233. doi:  10.1021/acs.joc.8b03203
7. Sequential Metal-free Thermal 1,3-Dipolar Cycloaddition of Unactivated Azomethine Ylides. Selva, V.; Selva, E.; Merino, P.; Nájera, C.; Sansano, J. M. Org. Lett. 2018, 20, 3522-3526. doi:  10.1021/acs.orglett.8b01292
8. Catalytic Enantioselective Cloke-Wilson Rearrangement. Ortega, A.; Manzano, R.; Uria, U.; Carrillo, L.; Reyes, E.; Tejero, T.; Merino, P.; Vicario, J. L. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 8225-8229. doi:  10.1002/anie.201804614
9. UDP-GlcNAc Analogs as Inhibitors of O-GlcNAc Transferase (OGT): Spectroscopic, Computational and Biological Studies. Ghirardello, M.; Perrone, D.; Chinaglia, N.; Sádaba, D.; Delso, I.; Tejero, T.; Marchesi, E.; Fogagnolo, M.; Rafie, K.; Aalten, D. M. F. v.; Merino, P. Chem. Eur. J. 2018, 24, 7264-7272. doi:  10.1002/chem.201801083
10. Inhibitors against Fungal Cell Wall-remodelling Enzymes. Delso, I.; Valero-Gonzalez, J.; Gomollón-Bel, F.; Castro-López, J.; Fang, W.; Navratilova, I.; Aalten, D. M. F. v.; Tejero, T.; Merino, P.; Hurtado-Guerrero, R. ChemMedChem 2018, 13, 128-132. doi:  10.1002/cmdc.201700720
11. (+)-Methyl (1R,2S)-2-{[4-(4-chlorophenyl)-4-hydroxypiperidin-1-yl]methyl}-1-phenylcyclopropanecarboxylate [(+)-MR200] Derivatives as Potent and Selective Sigma Receptor Ligands: Stereochemistry and Pharmacological Properties. Amata, E.; Rescifina, A.; Prezzavento, O.; Arena, E.; Dichiara, M.; Pittalà, V.; Montilla-García, Á.; Punzo, F.; Merino, P.; Cobos, E. J.; Marrazzo, A. J. Med. Chem. 2018, 61, 372-384. doi:  10.1021/acs.jmedchem.7b01584
12. Regioselectivity Change in the Organocatalytic Enantioselective (3+2) Cycloaddition with Nitrones Through Cooperative H-Bonding Catalysis/Iminium Activation. Prieto, L.; Juste-Navarro, V.; Uria, U.; Delso, I.; Reyes, E.; Tejero, T.; Carrillo, L.; Merino, P.; Vicario, J. L. Chem. Eur. J. 2017, 23, 2764-2768. doi:  10.1002@chem.201605350
13. Racemic Hemiacetals as Oxygen-Centered Pronucleophiles Triggering Cascade 1,4-Addition/Michael Reaction through Dynamic Kinetic Resolution under Iminium catalysis. Reaction Development and Mechanistic Insights. Orue, A.; Uria, U.; Roca-López, D.; Delso, I.; Reyes, E.; Carrillo, L.; Merino, P.; Vicario, J. L. Chem. Sci. 2017, 8, 2904-2913. doi:  10.1039/C7SC00009J
14. The small molecule luteolin inhibits N-acetyl--galactosaminyltransferases and reduces mucin-type O-glycosylation of amyloid precursor protein Liu, F.; X, K.; Xu, Z.; Rivas, M. d. l.; Li, X.; Lu, J.; Delso, I.; Merino, P.; Hurtado-Guerrero, R.; Zhang, Y. Journal of Biological Chemistry 2017, 292, 21304-21319. doi:  10.1074/jbc.M117.814202

PRINCIPALES PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

1.- Diseño racional y síntesis estereoselectiva de glicomiméticos. MINECO, 2014-2016 CTQ2013-44367-C2-1-P. 151.200 EURO. PI: Pedro Merino

2.- Diseño racional de glicomiméticos inhibidores de glicosiltransferasas. MINECO, 2017-2019 CTQ2016-76155-R. 172.800 EURO. PI: Pedro Merino

3. Estudios mecanísticos de reacciones de glicosilación y su aplicación al diseño de inhibidores de glicosiltransferasas. Ministerio de Ciencia, Innovacion y Universidades. PID2019-104090RB-100. 2020-2023. 163.350 EUROS PI: Pedro Merino Filella

COLABORADORES

Dr. Loredana Maiuolo. Università della Calabria. Cosenza. Italy
Prof. Jose Luis Vicario. Universidad del Pais Vasco. Bilbao. Spain
Prof. Jose M.  Lassaaletta. IIQ-CSIC. Sevilla. Spain.
Dr. Francesca Cardona. Universitá di Firenze. Italy
Prof. Dan van Aalten. University of Dundee. United Kingdom.
Prof. Sonsoles Martin-Santamaría. CIB-CSIC. Madrid. Spain.
Prof. Juan Luis Asensio. IQO-CSIC, Madrid. Spain
Prof. Eric Oldfield. University of Illinois, USA
Dr. Francisco Corzana. Universidad de La Rioja. Spain
Dr. Marcelo Guerin. CIC-Biogune. Bilbao. Spain
Prof. Pedro Gois. Universidade de Coimbra. Portugal.
Dr. Ramon Hurtado. Universidad de Zaragoza. BIFI. Spain

CONTACTO (opcional email, web personal o grupo, etc)
pmerino@unizar.es
bioorganica@unizar.es

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